电泳技术的展与应用

1、电泳技术的发展与应用 作者：张涛 吴刚 李丽娜 刘扬【关键词】 电泳电泳（Electrophoresis）是利用带电粒子在电场中发生移动的一种分离方法。近年来随着基因组学、蛋白质组学的发展，许多新的电泳技术也随之孕育而生。单细胞凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、双向电泳、毛细管电泳技术的产生，使得DNA及蛋白质在分离和测量方法上有了更精确的提高。另外高效毛细管电泳技术被认为是当今分离生物分子的最重要工具，已被列为人类基因组计划首选分离DNA片段的方法。同时这些先进的电泳技术在现代生物医学研究中也起到了非常重要的作用，本文即对以上几种新的电泳技术的发展与应用加以综述。1 单细胞凝胶电泳 单细胞凝胶电泳

2、（Single Cell Gel Electrophoresis Assay，SCGE）又称彗星试验（Comet Assay）。它的分离原理是根据当各种内源性或外源性DNA损伤因子诱发DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构被破坏，在细菌裂解液作用下，细胞内的蛋白质、RNA等扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量过大停留在原位。在中性条件时，残留的DNA片段可进入凝胶发生迁移，这时用碱处理或在碱性电解质条件下，DNA会发生解螺旋，释放出DNA断裂片段，由于这些DNA片段的分子量很小，在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像；而未损伤的DNA部分保持球形。在一定条件下，DNA的迁移距离

3、（彗星尾长）和DNA的含量（荧光强度）与DNA损伤呈线性相关，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移距离可以推测出DNA的损伤程度1。 由于SCGE具有敏感、简便、快速、低耗等优点，因此被广泛应用在DNA的损伤与修复、遗传毒理、环境监测以及氧化应激和细胞凋亡等研究中2。例如在检测外界因素对细胞核DNA的损伤中，SCGE有其独特之处，主要体现在它可以将各种类型的细胞的不同反应有效地反映出来3。利用单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞DNA的损伤，检测冰冻保存对外周血细胞DNA的损伤及检测人精子DNA链断裂等在文献中均有报道4-6。同时SCGE在DNA切除修复的研究中也具有重要作用7。切除修复是人类

4、DNA损伤修复的主要形式，利用SCGE可进行从损伤到切除修复、合成、连接等每个步骤各个时点的观察，可用于DNA修复的分子机理探讨，所以SCGE在检测DNA损伤及修复中有其他电泳不可替代的作用。 外来理化因素对细胞DNA的损伤是引起基因突变及癌症发生的重要因素，并且诱变DNA损伤和致癌效应也是遗传毒理学研究的重要内容。建立快速灵敏的DNA损伤检测方法，对于毒性因素的检测、细胞DNA的保护都是非常有益的。SCGE不仅能提供DNA损伤信息，还可提供环境物质改变修复过程的信息；运用SCGE在活体进行遗传毒理学研究，可了解药物的毒理作用在不同组织和细胞中的分布。Pool-Zobel8通过口服或吸入亚硝胺

5、的方法，采用SCGE研究药物的动物器官特异性作用，认为器官特异性基因毒性作用与器官特异性癌症密切相关。另外环境中的遗传毒物浓度一般很低，用经典的细胞学方法，如用染色体畸变实验（CA）、微核实验（MN）和姐妹染色体交换实验（SCE）进行生物监测时，很难得到明确的阳性结果，但利用SCGE检测低浓度遗传毒物具有高灵敏度，并且适用范围广，可检测各种类型组织细胞，特别是来自于直接与环境遗传毒物接触的人体细胞（如口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、食道黏膜细胞），对T淋巴细胞与B淋巴细胞均敏感，因此 SCGE这些年广泛用于环境监测9。如Rojas等10用SCGE检测墨西哥城居民脱落的泪管上皮细胞中DNA，发现由于

6、空气中的臭氧与碳氢化合物超标，通过观察泪管上皮细胞DNA受到损伤的程度，确定北部空气中的臭氧浓度偏高于南部地区。 细胞凋亡是细胞增殖、分化和死亡过程的重要调节机制，该机制发生紊乱与肿瘤发生密切相关。凋亡细胞在核碎裂早期出现大量DNA链缺口，在SCGE中大量DNA进入尾部，且迁移距离延长，甚至与“头部”分离，形成不同于一般损伤的特有形态。根据此形态可计算出细胞凋亡的比例，研究细胞凋亡的机理。由于SCGE的高度敏感性而且能够直接观测单个细胞DNA片段迁移，所以该技术在细胞凋亡检测中发挥着日益重要的作用11。另外SCGE在肿瘤学、放射生物学、人群监测、临床诊断与治疗等方面有也具有广泛的应用前景。2

7、变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophresis，DGGE）是一种实用价值较高研究DNA突变的分析方法。DGGE主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。当电泳开始时，DNA在胶中的迁移率仅与分子大小有关，一旦DNA移动到某一点，达到该DNA变性浓度位置时， DNA双链开始分开，从而降低了DNA的迁移速率。由于不同的DNA片段具有的碱基组成不同，使得变性条件产生差异，在凝胶上形成不同的条带，从而可以区分DNA突变型和野生型，可以进一步进行基因突变的分析。 另外DGGE还可与PCR联合使用，利用此项技术可以准确鉴定出单碱基替换、移框突变

8、和少于10个碱基的缺失突变。通常先用病人的基因组DNA或者是有突变个体的DNA进行PCR扩增，然后用DGGE进行分析。最早由DGGE筛查的人类基因是珠蛋白位点，以后又有很多位点被筛查，如生长因子基因、生长因子基因等。并且该法适用于大样本的筛查，对一些罕见突变型的筛查也十分有用。 PCR-DGGE的另一个作用是可分析突变组成即突变谱。主要是利用诱变剂体外诱变人类原始淋巴细胞株，使之生成大量的HPRT-突变体，然后进行PCR扩增，用DGGE分析。用定量PCR-DGGE方法还可以确定标本中某特异DNA序列的拷贝数。其原理是将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增，然后DGGE分离两者的扩增产物，

9、根据其比率可以确定标本中靶基因的拷贝数。 DGGE经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳（Constant Denaturant Gel Electrophresis，CDGE），瞬时温度梯度电泳（temporal temperature gradient electrophoresis，TTGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等三种类型。现在上述方法广泛应用于突变分析、遗传病的诊断和肿瘤相关基因的筛查等方面12。 其中CDGE是由DGGE改变而来，二者的主要化学物质和基本方法相似，只是凝胶浓度由垂直DGGE来确定，

10、用均一的变性浓度凝胶代替梯度凝胶，使得整个电泳变得更加简单快速。TTGE检测突变的能力和DGGE相接近，但却不需要变性梯度胶。基本方法是：在含有一定浓度尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使外界的温度不断增加，这样在跑胶的过程中形成一个温度梯度。变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成，这样使得全过程更加简单迅速，分辨率极高。在TGGE中，变性剂形成的梯度被温度梯度所代替，温度梯度由微处理器控制。它与DGGE相比，更加稳定可靠，使得它的应用最为广泛。我国赵永忠等13应用TGGE成功地分析了非缺失型地中海贫血突变。Horn等14采用TGGE方法对-型神经纤维瘤（NF）患者进行普查，发现了NF

11、基因3个新突变。随着对各种遗传病和肿瘤分子病理研究的深入，人们发现的遗传病和肿瘤相关基因也会日益增多，TGGE技术也会得到更多的应用。3 双向电泳 双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis，2-DE）作为蛋白质组研究的核心技术之一，目前是分析蛋白质中分辨率最高的工具，因此日益受到人们的关注15。近些年双向电泳技术得到了不断的发展和改进，成为分析复杂蛋白质混合物的有效工具，应用于分析当环境变化时细胞增殖、分化、遗传变异、肿瘤发生等过程中的基因表达产物16。双向电泳是将两个独立参数（等电点和分子量）结合起来的电泳技术。首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度胶中进行等电

12、聚焦电泳（Isoelectric Focusing，IF）将蛋白分离，然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），完成第二次分离。根据第一向等电聚焦电泳条件的不同，可将2-DE分为三种系统：第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行，两性电解质在外加电场作用下形成梯度，该系统称为ISO-DALT。这类电泳的主要缺点是pH梯度不稳定，重复性差，上样量低，不利于不同实验室间进行图谱分较；如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines共聚，形成具有pH梯度的凝胶，这种系统称为IPG-DALT系统，该系统pH梯度稳定，不依赖于外加电场，基本上克服

13、了ISO-DALT的主要缺点，无论是重复性和上样量等方面均优于ISO-DALT。第三种是非平衡pH梯度电泳，主要用于分离碱性蛋白质。 蛋白质双向电泳图谱中可显示众多的蛋白质斑点，用图像扫描仪等采集到原始图像后，经背景和污点的校正，可滤掉一部分背景及去除部分水平和垂直条纹，把凝胶上的蛋白质数字化，可获得斑点面积、每点相对黑度等参数。根据标准蛋白（也可用内标，即蛋白质组内的成员），把得到每个蛋白斑点的等电点和相对分子量集中建立数据库。通过此数据库可以提取和发现已知和未知的蛋白质。 与经典的生物化学方法不同，双向电泳的最大优势在于它可对一系列复杂的蛋白质进行分析，而不仅只局限在某一个蛋白质的变化。通

14、过将疾病和对照组相关部位的蛋白组进行双向电泳，然后扫描双向电泳图谱中分离的蛋白斑点，在蛋白图形工作站中，应用Melanie软件，对不同蛋白斑点的分布部位、斑点面积及灰阶、背景过滤，进行2-DE匹配及比较，建立参考图谱，最后对比找到斑点的变化，如附加斑点、丢失斑点以及强度上的差异等，这样往往能够发现疾病相关蛋白。 双向凝胶电泳蛋白斑点的矢量图（vector map of the 2-D gel）亦被经常使用。如翻译后的修饰和加工对于蛋白质的正常生理功能是必需的，其变化与疾病的发生相关。如果将双向电泳位置与理论预测位置连一直线，即为该蛋白的矢量，如果一个蛋白有多个矢量，表明该蛋白可能有多个翻译后修

15、饰17。4 高效毛细管电泳技术 高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）是80年代后期迅速发展起来的一项新技术，由于它具有高分辨率、高灵敏度、重复性好、可进行定量分析和自动化高等诸多优点，在短短几年时间里就已经成为蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的一项重要技术。可以认为，HPCE技术的产生使电泳技术进入一个全新发展阶段18。HPCE采用硅烷类石英毛细管柱作为分离部件，毛细管柱内径小、表面积大、散热较好、能够在高电压下进行电泳，这种与色谱过程类似的分离模式可使HPCE的最高柱效能达到106理论塔板数，为分离提供了高

16、的分辨率。同时，由于采用了相应的进样系统和检测系统，使HPCE具备了分离、鉴定和定量分析的能力。 HPCE在生物医学中的应用十分广泛，尤其在蛋白质、多肽、核酸组成的分析方面已取得显著成效。如HPGE可用于蛋白质分子经胰蛋白酶酶解后产生的肽段的分离，并由此得到蛋白质的指纹图谱。HPCE还用于生物技术产品指纹图的研究。重组DNA技术生产的蛋白质类药物经特定酶或化学法水解后，用色谱分离可得到不同的多肽片段的指纹图，不同蛋白质的指纹图具有特征性，这对于蛋白质结构研究和特征性鉴别具有重要的意义。同时HPCE还为蛋白质和多肽的纯度鉴定提供了一种快速、准确的方法 19。另外 HPCE的高分离效能和所需样品量

17、少的特点，也为药物分析及药物体内代谢研究提供了切实可行的分析方法20。HPCE的另一重要作用是对低分子量核酸的分离，有报道利用HPCE在30 min内完成40 1 700个碱基对的DNA片段分离，这使HPCE在DNA序列分析上发挥重要作用21。此外，HPCE在环境分析、临床分析以及细菌或病毒颗粒表面研究、细菌代谢产物测定等方面的应用也日渐增多。 电泳技术的发展已有近80年的历史，在早期电泳技术得到了迅猛发展，许多新的电泳技术不断涌现，尽管最近几年电泳发展的脚步缓慢了，但在某些领域仍取得了突破，如空间电泳技术的出现。如今电泳技术正向着全面化、综合化、简便化及实用化方向发展，同时电泳芯片的发展也必

18、然会给电泳技术带来一场新的技术革命。【参考文献】 1田云，卢向阳，易克，等. 单细胞凝胶电泳技术J.生命的化学，2004，24（1）：77-80.2邢彩虹，李桂兰，尹松年. 单细胞凝胶电泳技术及其应用进展J. 卫生研究， 2004，33（5）：638-640. 3陈安. 单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤J. 国外医学.临床生物化学与检验学分册，1998，19（4）：145-146. 4孟建锋，庄志雄，倪祖尧. 单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞的DNA损伤J.中华劳动卫生职业病杂志，1997，15(6):334-337.5倪祖尧,逢兵,孟建锋，等. 单细胞电泳检测冰冻保存对外周血细胞DN

19、A的损伤J.中国公共卫生报，1997，16(5):313-315.6 徐德祥，沈汉民，王俊南.单细胞电泳用于检测人精子DNA链断裂J. 中华医学遗传学杂志，2000，17(4):281-284.7 韩宗超，张苏明.单细胞凝胶电泳在DNA损伤与修复检测中的应用J.中华检验医学杂志，2000，23（3）：180-182.8 Pool-Zobel BL, Klein RG, Liegibel UM ,et al. Systemic genotoxic effects of tobacco-related nitrosamines following oral and inhalational adm

20、inistration to Sprague-Dawley ratsJ. Clin Investig ,1992,70(3-4)：299-306. 9 邱志群. 单细胞凝胶电泳技术在环境生物监测中的应用J.国外医学.卫生分册，2002，29（1）：20-25.10 Calderon GL，Osnaya N，Rodriguze A，et alDNA damage in nasal respiratory epithelium from children exposed to urben pollutionJ.Environ Mol Mutagen,1997，30(1):11-30.11 张建平，陈道达. 单细胞凝胶电泳技术及其应用J.国外医学.遗传学分册,1997，20（5）：231-235.12 刘上峰,傅俊江. 变性梯度凝胶电泳的原理、应用及其进展J .国外医学.遗传学分册, 2002，25(2):74-76.13 赵永忠,徐湘民,杨阳.应用温度梯度凝胶电泳分析非缺失型-地中海贫血突变J .中华医学遗传学杂志, 2001，18(1):51-55.14 Horn D, Robinson PN, Boddrich A, et al. Three novel mutations of the N