表面与界面课题组实验方法整理

1、第一章 细胞实验相关1.1细胞培养、增殖或毒性检测1.1.1 细胞培养：1. 将冻存细胞从液氮中取出，37 °C 水浴解冻。2. 将解冻细胞悬浮液从冻存管中转移到离心管中，1000 r/min离心5 min.3. 离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打之后再次离心处理一次4. 离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打5. 将吹打均匀的细胞悬浮液转移到细胞培养皿中，并加入适量新鲜培养基，放到细胞培养箱中培养6. 细胞培养3、4天左右培养皿中细胞覆盖率80 %左右分盘继续培养，最后根据实验样品数目计算所用细胞数合理进行分盘满足实验所用1.1.2 细胞增殖：1. 样品消毒处理

2、：根据样品不同，可以选择高压蒸汽灭菌、酒精消毒、紫外照射消毒。2. 培养有细胞的培养皿从培养箱中取出，移去培养基， PBS冲洗两遍，加入适量胰酶（预先预热，小盘0.5 ml，大盘1 ml），放在培养箱中23 min，在显微镜下观察细胞解粘附即可（细胞形貌成球形），加入新鲜培养基，充分吹打培养皿底部，将细胞悬浮液转移到新离心管中，离心1000 r/min离心5 min。3. 离心后，将离心管中上清液去掉，加入适量新鲜培养基，充分吹打，形成细胞分布均匀的悬浮液，取10 µl，用细胞计数器在显微镜下进行细胞计数，得到细胞悬浮液中细胞浓度4. 根据样品数量计算所用细胞总数（单个样品细胞接种密

3、度为5 × 104）以及所用含细胞的悬浮液体积（单个样品所用含细胞的悬浮液200 µl），根据前一步所得细胞浓度，取一定体积悬浮液，加入新培养基，配制满足实验需要的含细胞的新悬浮液，充分吹打，制得用于接种的细胞悬浮液。5. 消毒后的样品转移到细胞培养板中，PBS清洗两遍（每次10 min），每个样品预先加入800 µl培养基，然后加入200 µl含有细胞的悬浮液，轻轻摇晃混合均匀，放入细胞培养箱中培养1、4、7天。6. 细胞培养到预定时间，进行定量分析的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品转移到新的培养板中，加入0.5 ml含有10 % Alarm

4、aBlue的新鲜培养基，继续培养4 h。4 h之后，摇晃均匀后，取出100 µl培养基转移到96孔板中，在波长570 nm和600 nm下测量吸收值，根据公式计算得到细胞的增殖率。7. 细胞培养到预定时间，进行表面形貌观察的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品转移到新的培养板中，加入2.5 %戊二醛溶液，4 °C避光过夜保存进行细胞固定。之后样品依次用30 %，50 %，75 %，90 %，95 %，100 %的乙醇/水溶液进行脱水，之后用六亚甲基硅烷/乙醇溶液（1:2，2;1和纯六亚甲基硅烷）进行干燥，在通风橱中充分干燥后，表面喷金用扫描电镜观察细胞形貌。1.1.3

5、 细胞毒性：用样品直接测试毒性和细胞增殖实验步骤一样，如果用浸提液做步骤稍作改变即可，如下：1. 样品浸提液制备，将消毒样品在培养基中浸泡24 h，所得浸提液为100 %浸提液，可以根据需要和设计稀释为不同浓度的浸提液2. 将细胞提前接种于96孔板中，培养一天，之后将原培养基移除，加入浸提液共同培养，继续培养预定时间（比如1 d或3 d）3. 与测定细胞增殖方法一样，测量与细胞浸提液共同培养后细胞增殖速率，与阴性对照和阳性对照组比较，计算得到细胞活性，从而判断浸提液对细胞生长是否显示毒性1.2干细胞骨架染色1.2.1 经验分享因PEEK分子中苯环结构会在汞灯光源下被激发出荧光，致使背底荧光较深

6、，无法识别细胞，因此有关荧光染色的实验均不适用于PEEK材料。1.2.2所需用具及药品PBS（细胞房内/外用），4%PFA，0.1V%Triton X-100，1wt%BSA，FITC，DAPI，指甲油或502，盖玻片（提前准备好用24孔板切割成的独立小孔罩，并超声清洗干净，以保护样品用于观察）。1.2.3 实验步骤注意：整个固定、染色及观察过程需在避光环境中进行，以防荧光过早淬灭1. 接种细胞，1 x1样品（每组34个，每个时间点各1个），密度5x104 cell/ml；2. 到时间后（一般为1/4/24h或1/3/6/24h，根据具体情况定），将样品换至新的24孔板，以去除24孔板中样品外

7、细胞的影响，用PBS清洗2遍，每遍5min；3. 用4%PFA固定10min，用量为每孔500L；4. PBS清洗3遍，每遍5min；5. 用0.1V%Triton X-100通透，每孔500L，时间2min; (PBS稀释：50mL PBS中加50L Triton)6. PBS清洗3遍，每遍5min；7. 加入500L 1wt%BSA（用PBS稀释），时间20min；8. PBS清洗1遍，5min；9. 加入100L（PBS和FITC混合液），染骨架，60min（1h）；(配制比例为1.2ml PBS：20LFITC)10. PBS清洗3遍，每遍5min；11. DAPI染核5min，每孔加

8、入500L；(配置比例为DAPI：PBS=1:1000)12. PBS清洗3遍，每遍5min；13. 准备好盖玻片，上滴约5L抗荧光淬灭剂，将样品正面朝下反扣至抗荧光淬灭剂上（注意尽量避免气泡），然后用经超声清洗的24孔板小孔罩罩住样品并进行标记，四周涂上指甲油或502固定样品；14. 置于荧光显微镜暗场模式下进行观察并拍照。1.3干细胞矿化1.3.1 经验分享对染料吸附严重的材料体系（如纳米多孔材料）以及表面胶体分散性较差的材料体系（如Zeta电位绝对值小于20）因对染料吸附较牢使得多余的染料难以经蒸馏水洗去，而在后续定量过程中又能经10%CPC洗脱从而使定量结果严重偏大，因此不适用此法。1

9、.3.2所需药品PBS（细胞房内用），75%酒精；蒸馏水（或超纯水），10v%氨水（ammonium hydroxide）：40mM茜素红(alizarin red)：称取2g茜素红溶于100ml蒸馏水，混合均匀后用10%氨水调节pH至4.14.3，The pH is critical, so make fresh or check pH if the solution is more than one month old。10%氯化十六烷吡啶(Cetylpyridinium chloride, Cat NO.：30037326(国药)：10g CPC+100ml水。10 mM磷酸钠(Na3P

10、O4，sodium phosphate)：称取磷酸钠1.64g，用水溶解定容到1000ml。1.3.3 实验步骤1. 接种细胞，1 x1样品（每组8个，7/14d各4个），密度一般取1 x104 cell/ml for 7d and 0.5x104 cell/ml for 14d or 1 x104 cell/ml for both 7 and 14d；2. 到时间后（7d/14d），将样品换至新的24孔板，用 PBS 漂洗三次然后用 75%的酒精固定 1 h；3. 固定完后再用 PBS 漂洗三次；4. 用溶解在饱和苦味酸中的 0.1%天狼星红对细胞分泌的胶原进行染色，染色过程持续 18 20

11、h；5. 到时间点后用 0.1 M 的乙酸反复漂洗试样直至无颜色析出为止，体式显微镜照相（荧光显微镜明场模式）；6. 为了进行定量比较，每孔加入 500 ml 的洗脱液（用 0.2 M 氢氧化钠和甲醇以 1：1 的比例配制），振荡 15 min 将试样表面的染料洗脱下来，在 540 nm 测其吸光度。1.4 qPCR实验方法1.4.1 细胞培养和提取3个2x2的大片，放于一个小培养皿中，细胞密度为7天1x105，14天减半，并加入4mL 培养基，每隔3天换液，培养相应时间点(7，14天)后，将样品换到新的培养皿中（镊子须酒精烘烤灭菌），用PBS清洗2遍，并加入1mL TRIzol试剂，用枪头反

12、复吹打样品表面以使细胞全部裂解，将TRIzol试剂收集后放入1.5mL离心管中待用，-80保存或进行下一步实验。1.4.2 RNA提取将提取的细胞放于常温解冻，孵化后加入0.2mL氯仿并剧烈振荡15s，室温放置2-3min后进行离心（离心参数12000xg，15min，4）；离心后可见液体分成，去上层清液约0.5mL（attention：勿取到下面红色液体），之后加入0.5mL异丙醇并上下轻微晃动，室温放置10min后进行离心（离心参数12000xg，10min，4），此时可见RNA沉积于离心管底部；之后取出所有液体，只残留RNA，并加入1mL75%酒精（attention：75%酒精用DEP

13、C水配制），进行离心（离心参数7500xg，5min，4），吸出所有液体，并室温放置5-10min进行干燥；加入20-50L去RNA酶水，于55-60水浴锅中孵育10-15min，之后放于-80 冻存或进行下一步实验。1.4.3 RNA纯度和浓度计算将提取的RNA稀释100倍（去5l稀释到500l），并用紫外分光光度计测试其在260nm和280nm处波长，其中OD260/OD280计算RNA纯度（该值大于1.5方可进行后续实验，否则重新提取细胞，应为1.82）；RNA浓度 = OD260 x 40 x 100（100为相应的稀释倍数），单位ng/L。1.4.4 反转录：需在冰盒上操作该步操作的

14、主要目的是将RNA反转录成cDNA。通过第3步计算得到的RNA浓度，取1gRNA进行反转录实验。实验体系为13L。依次加入1gRNA，1L Anchored-oligo（dT）18引(vial 5)物，剩余液体加水(vial 7)补满；用反转录仪在65 下加热10min；取出后立即放于冰上，依次加入4L vial 2，0.5L vial 3，2L vial 4, 0.5L vial 1，总体积从13L增加到20L；在用反转录仪在55下加热30min；后立即85加热5min，立即放于冰上或者-20冻存或进行下一步实验。1.4.5 qPCR进行qPCR实验前，先了解我们所用的gene primer

15、，首先reference gene 是Actin，target gene有Runx2，OCN，Col-I， ALP，BMP2，OPN共6种，其中primer分为两管，分别标记为F和R，进行qPCR实验时所用的反应体系是10L，其中包括5L Mixture buffer，0.5L primer F，0.5L primer R，1L反转录后的cDNA（一般需将第4步得到的cDNA稀释，稀释倍数可为1x，10x，100x，须根据自己实验体系摸索合适的浓度），3L RNA专用水。根据之前个人经验，可将反转录后的cDNA稀释10x进行操作；此外，由于需要进行3个复孔实验，在用离心管加试剂时可先配制35L

16、的反应体系(只配置30L不够，液体溶解后体积缩小)，相应的试剂应为17.5L Mixture buffer，1.75L primer F，1.75L primer R，3.5L反转录后的cDNA，10.5L RNA专用水。加好后进行段时间离心(约5s)。将配好的反应体系按照每孔10L分装到96孔板(qPCR专用) ，并用膜封好96孔板，进行离心(约5s)，离心好后进行qPCR实验。第二章细菌相关实验2.1 细菌复苏2.1.1 经验分享1. 15ml 离心管盖子旋紧问题：大肠杆菌，厌氧，扭紧；金黄色葡萄球菌，耗氧，不扭紧2. 离心管使用前用紫外灯照射15min3. 实验时只能使用P2代菌液4.

17、OD-0.1，细菌浓度约为通常使用的菌液浓度 1*108 CFU/mL，稀释10倍后 1*107 CFU/mL2.1.2 实验步骤1. 将菌液从-80度冰箱取出，放入超净台中解冻2. 培养基提前30min预热（37度），在15ml离心管中加入10ml B型培养基（无琼脂培养基）和0.1ml菌液，摇匀，放入37度烘箱、静置5h3. 将菌液取出，用枪头蘸菌液（200ul量程的枪头）涂在含A型培养基（琼脂培养基）的基板上（沿着波浪线，轻轻地，不划破培养基），倒置放入37度烘箱15h4. 将10ml B型培养基加入15ml 离心管，37度预热30min，取出基板，挑选单个菌落，用枪头挑起，将枪头连同细

18、菌放入离心管，摇匀，于37度烘箱中放置5h6-8 h（注意：挑菌落时，两次，有2个15ml 离心管，一个用于实验，一个用于备用。备用的于37度培养5h后放于4度冰箱即可，此时的菌液为P1代）5. 重复步骤36. 重复步骤4，这时挑1-3个菌落，2管备用，得到P2代7. 都放置于4度冰箱保存8. 用后的涂板放于4度冰箱保存2.2抗菌实验及方法2.2.1 溶液配制1. 大肠杆菌(E. Coli) 配制LB琼脂板：（10g胰蛋白胨+5g酵母提取物+10g氯化钠），摇匀后加入12g琼脂，继续摇匀，定容至1L，高温高压灭菌，倒板。1L培养基约可倒板60块。2. 金黄色葡萄球菌(S.aureus)配制TS

19、B琼脂板：30g TSB溶液摇匀后加入12g琼脂，继续摇匀，定容至1L，高温高压灭菌，倒板。2.2.2 细菌接种取200ul振荡（10-30s）后的细菌（S.a/E.coli）原液加入15ml的离心管中，用1.8ml0.9%的Nacl稀释10倍后，振荡10-30s置于37的冰箱中培养(预热)30min。取培养好的细菌稀释液加入到装有试样的24#孔板中，每个孔板对应60ul的细菌培养液，将种植好细菌的试样置于37的冰箱中培养24h。（注意：种植细菌前需要在孔板之间的空隙中需要添加一定的0.9%Nacl）。2.2.3 细菌染色观察1. 3ul PI+3ul GF（Green florescent nucleic acid stain）+2ml水配制染料（根据实际需要按照这个比例配制），取经24h细菌培养好的试样，生理盐水清洗两遍，每个样品加入500ul配制的染料（常温避光）处理15min后吸出，遮光放置干燥一段时间后，在盖玻片上添加（抗荧光淬灭剂）（5ul每试样），并将试样置于涂有抗荧的盖玻片上，然后用指甲油和孔板固定好试样随后进行荧光观察。（配置好的染料可常温保存使用，PI和GF都需要遮光处理）。