PCR技术的原理及应用

1、整理课件1PCR技术的原理及应用技术的原理及应用整理课件2PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长整理课件3PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物整理课件4PCR技术简史DNA的复制核酸体外

2、扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶整理课件5PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Kh

3、orana的设想被人们遗忘了整理课件6PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖整理课件7 整理课件8整理课件9整理课件10引物引物整理课件11引物引物引物引物整理课件12XX整理课件13整理课件14()40 5

4、0 60 70 80 90 100100 80 60 40 20整理课件15整理课件16PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L整理课件171234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DN

5、A加倍整理课件18PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95整理课件19PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物整理课件20PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶整理课件21PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始整理课件22PCR

6、的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq整理课件23PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束整理课件24PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增整理课件25q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR在医学和科研中的应用在医学和科研中的应用提提 纲纲整理课件26 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利

7、用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义整理课件27常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析。进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。测。实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理整理课件28实时定量实时定量PCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反

8、应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准曲和标准曲线的分析对线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析。定量分析。 整理课件29如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析三个概念：三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理整理课件30整理课件31实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCy

9、cle）；）；纵坐标：纵坐标：荧光强度荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件整理课件32实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号

10、:荧光信号超过域值整理课件33实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t) value 整理课件34实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性整理课件35实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0

11、 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率整理课件36实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增

12、达到域值域值的循环数即的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。就可计算出样品中所含的模板量。整理课件37实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。整理课件38Sample实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 绝对定量绝对定量25整理课件39提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q

13、 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用整理课件40非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR整理课件41实时荧光定量实时荧光定量PCR PC

14、R 方法方法 1 1 SYBR Green 法整理课件42SYBR Green 法q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR Green 整理课件435353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation整理课件44温度温度荧光强度荧光强度Tm整理课件45

15、-dIdTTm整理课件46SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产非特异性产物物整理课件47Cycle numberFlourescenc 104 102SampleCycle numberLg of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。q Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。整理课件48SYBR Green 法 -PCR反应的建立

16、反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化: :SYBR Green SYBR Green 使用浓度使用浓度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，荧酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测光信号太弱，不易检测PrimerPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgClMgCl2 2的浓度的浓度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以减少非特异性产物以减少非特异性产物反应反应Buffer Buffer 体系的优化体系的优化反应温度和时间参数反应温度和时间参数: :由酶和引物决定由酶和引物决定1. 1.其他与常规其他与常规PC

17、RPCR相同相同整理课件49SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。整理课件50SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点整理课件51本单位目前开展的工作 多

18、种病原体定量和定性多种病原体定量和定性 细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等）细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等） 基因表达水平检测基因表达水平检测 PCR芯片芯片整理课件52实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 2 -TaqMan -TaqMan法法整理课件53与目标序列互补TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针v 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等等 v 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，

19、R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R R与与QQ分开，发荧光分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，（荧光共振能量转移原理，FRETFRET）v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针整理课件54TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光整理课件55TaqMan TaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1 1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针探针TmTm为为68-70 68-70 ，30 bp, 530 b

20、p, 5不能有不能有G G，G G可能会淬灭荧光素，可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp400 bp，引物，引物TmTm为为59-60 59-60 2 2、反应参数的确定：、反应参数的确定： 一般为：一般为：94 94 ，10-20S10-20S 60 60，30-60S30-60S（TaqTaq酶酶5353外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 60 最高）最高） 也可通过温度梯度优化退火温度也可通过温度梯度优化退火温度 72 72 ，45 S45 S，3 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小CtCt值，最大信号值，最大

21、信号/ /背景比值背景比值 引物浓度：引物浓度：50-900nM50-900nM 探针浓度：探针浓度：50-250nM50-250nM4 4、其他与常规、其他与常规PCRPCR相同相同整理课件56已肝病人血液中已肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量q目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q方法：从血液中提取病毒方法：从血液中提取病毒DNADNA，扩增病毒基因，以，扩增病毒基因，以TaqManTaqMan探针进行检测探针进行检测q设置对照：浓度为设置对照：浓度为10106 6、10105 5 、10

22、104 4 、10103 3 的标准样品各一个，设阴性和空白的标准样品各一个，设阴性和空白对照对照q实验步骤：提取实验步骤：提取HBV DNAHBV DNA 设计特异引物设计特异引物 设计设计TaqManTaqMan探针并标记探针探针并标记探针 扩增程序扩增程序q结果：获取血液样品中结果：获取血液样品中HBV DNAHBV DNA的精确的精确copycopy数数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV整理课件57数据分析分析结果： HBV DNA的精确copy数为 3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBVsamp

23、lesample整理课件58TaqManTaqMan法法 应用范围应用范围q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q 单核苷酸多态性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP)整理课件59TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点整理课件60实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3 3 - Molecular beacon - Molecular beacon

24、法法( (分子信标分子信标) )整理课件61标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针整理课件62Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET）q 探针与探针与DNADNA杂交时产生荧光杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号信号整理课件63Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标

25、分子信标) ) 应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP分析整理课件64Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 优缺点优缺点q高特异性：高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点整理课件65几种方法总结几种方法总结化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂信号检测信号检测主要应用范主要应用范围围SYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小沟中的小沟中否否复性复性/ /延伸延伸熔解曲线分析熔解曲

26、线分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因Molecular Beacon发夹型杂交探针发夹型杂交探针有有复性复性SNPSNP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针（5-35-3外切）外切）有有任何步骤任何步骤SNPSNP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因整理课件66实时荧光定量实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量整理课件67绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（浓度（DNA，RNA）病毒病毒DNA或或RNA

27、的拷贝数的拷贝数转基因的拷贝数转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含相对定量：计算初始反应模板的相对含量量差异表达分析差异表达分析芯片评估芯片评估转基因生物的检测转基因生物的检测基因型检测基因型检测整理课件68实时荧光实时荧光PCR绝对定量方法绝对定量方法unknown104103标准品，标准曲线标准品，标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释根据实时根据实时PCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)，构建标准曲，构建标准曲线线样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)值值整理课件69

28、使用实时荧光定量使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势进行绝对定量的优势 敏感性高敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品：区分小差异样品：24，48，96， 大范围拷贝数样品同时检测大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效省时有效整理课件70实时荧光相对定量实时荧光相对定量 相对定量的相对定量的目的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别 内标基因内标基因内标通常是内标通常

29、是b-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个内标基因拷贝内标基因拷贝整理课件71提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用整理课件72实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内

30、标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNADNA和体外转录的和体外转录的RNA RNA 整理课件73实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法标准样品标准样品用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克

31、隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释分子量换算成拷贝数，做系列稀释整理课件74实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线曲线q 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）的表达差异（不同时相）v 2 2- -C C（t t）v 双标准曲线法双标准曲线法整理课件75 TaqManTaqMan法举例法举例 标记探针标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量