最新工具酶与基因工程 POWERPOINT 演示文稿

1、 第一部分第一部分 工具酶与基因工程工具酶与基因工程 一限制性核酸内切酶一限制性核酸内切酶 1限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现 2i类和类和iii类限制和修饰酶的基本特征类限制和修饰酶的基本特征 3ii类限制和修饰酶的基本特征类限制和修饰酶的基本特征 4甲基化酶的基本特征甲基化酶的基本特征 二其它工具酶其它工具酶 1 dna连接酶连接酶 2聚合酶聚合酶 3末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(tdt) 4. si核酸酶核酸酶 5bal31核酸酶核酸酶 6碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶 限制性内切酶限制性内切酶 (restriction endonuclease)* 存在于任何一种

2、原核细菌中存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链在特异位点上催化双链dna分子的断裂分子的断裂,产生相应的限制性产生相应的限制性片段片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类在生物分类,基因定位基因定位,基因重组基因重组,疾病诊断疾病诊断,刑事侦察领域极为刑事侦察领域极为重要重要. 一限制性内切酶的发现：一限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用)宿主细胞的限制和修饰作用：宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入两种不同来源的入-噬菌体噬菌体 入入k；入；入b，能高频感染各自大肠杆，能高频感

3、染各自大肠杆菌宿主细胞（菌宿主细胞（ k株株 ，b 株株 ）。）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但一但 入入k 噬菌体在噬菌体在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入k 后代，能感后代，能感染染 b 株株, 不能感染原来不能感染原来 k株株.1 宿主细胞的限制和修饰作用；宿主细胞的限制和修饰作用；1两种不同来源的入两种不同来源的入-噬菌体噬菌体 （ 入入- k ，入，入-b ）。）。2能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ k株株 ，b 株株 ）。）。3当它们分别与其它宿主

4、菌交叉混合培养时，当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， （ 入入k-b ，入，入b-k ）感染下降数千倍。）感染下降数千倍。4一但一但 入入k 噬菌体在噬菌体在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入-k 后代，能感染后代，能感染 b 株株, 不能再感染原来不能再感染原来 k株株. 称为：宿主细胞的限制和修饰作用称为：宿主细胞的限制和修饰作用二限制和修饰作用的分子机制二限制和修饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 k株，株，b 株株 ，有各自的限制和修饰系统。，有各自的限制和修饰系统。1） 它们均有三个连续的基因位点控制，它们均有三个连续的基因位点控制，hsdr;

5、 hsdm; hsds.2） hsdr编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别dna分子特定位点，分子特定位点，将双链将双链dna切断。（切断。（dna分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉hsdr基因位点）基因位点）3） hsdm编码产物是编码产物是dna甲基化酶甲基化酶-催化催化dna分子特定位点分子特定位点的碱基甲基化反应。的碱基甲基化反应。4） hsds表达产物的功能是表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。化酶，识别特殊的作用位点。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞

6、 k株，株，b株株 中，中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体dna和噬菌体和噬菌体dna 特异性保护特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）（修饰） 3当外来当外来dna入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制）（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数dna分子在宿主细胞中繁殖过程分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5但丧失在原宿主细胞中的存

7、活能力，因为接受了新宿主菌甲但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但一但 入入-k 噬菌噬菌体在体在 b 株成功，由株成功，由 b 株繁殖出株繁殖出 入入-k 后代，能感染后代，能感染 b 株株, 不不能感染原来能感染原来 k株株.) 6细菌利用限制和修饰系统来区分自身细菌利用限制和修饰系统来区分自身dna与外来与外来dna。c株不能产生限制性内切酶，其它来源入株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌噬菌体可以感染体可以感染c株，而在株，而在 c株繁殖入株繁殖入- 噬菌体则在噬菌体则在 k株和株和

8、b 株株 受到严格的限制作用受到严格的限制作用三三 限制性内切酶的分类：（三大类）限制性内切酶的分类：（三大类）i i类，类， ii类类, iii类类.2 i类，类，iii类为限制类为限制-修饰酶。修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在单位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。3 ii类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点 专专 一，适合于一，适合于dna重组。重组。四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统四原核细胞中限制和修饰系统 i类酶类

9、酶 ii类酶类酶 iii类酶类酶 酶分子酶分子 三亚基双功能三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离内切酶与甲基化酶分离 二亚基双二亚基双 能能 识别位点识别位点 二分非对称序列二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构序列，回文结构 5-7bp非对称序列非对称序列 切割位点切割位点 距识别位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点在识别位点中或靠识别位点 在识别位点在识别位点 下游下游24-26bp限制性反应限制性反应 互斥互斥 分开反应分开反应 同时竟争同时竟争与甲基化反应与甲基化反应限制作用限制作用 需要需要atp 需要需要 需要需要 不需要不需要 五五i类酶，类酶，iii类酶限制类酶

10、限制-修饰酶基本特怔修饰酶基本特怔 1）i类酶，类酶，ecok，ecob。（1）异源多聚体，亚基）异源多聚体，亚基r.m.s分别具有限制分别具有限制,修饰酶的作用，特修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。异性位点识别活性。（2）i类酶与类酶与 dna识别位点结合依赖亚基识别位点结合依赖亚基 m与辅助因子与辅助因子s腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸(sam)相互作用。相互作用。（3）s腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(sam)通过变构作用使酶处于活性状态，通过变构作用使酶处于活性状态，酶与酶与 dna识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制性，或限制, 或

11、限修饰，或不限制不限修饰或限修饰，或不限制不限修饰 2）iii类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔（1）亚基）亚基r，ms亚基组成。亚基组成。ms亚基具有识别和甲基化修饰亚基具有识别和甲基化修饰双重作用双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 mboii 识别识别 5-aaga- 3 切割位点切割位点 5-gaagannnnnnnn/n-3 3-cttctnnnnnnn/nn-53）ii类限制修饰酶基本特怔类限制修饰酶基本特怔（1） 命名规则：命名规则： 生

12、物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称基本名称 + 菌株名的字母菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序）罗马字母（发现顺序） hid iii haemophilus infuenzae d株中的第三个酶株中的第三个酶 ecor i 基因位于基因位于escherichia coli 抗药性抗药性r质粒上质粒上 e co r i 细菌属名细菌属名 细菌种名种细菌种名种 菌株类型菌株类型 有几种限制酶有几种限制酶（2）特点）特点 a识别序列识别序列 4，5 或或 6个碱基对，个碱基对， ecor i 识别识别 5-g/aattc

13、- 3 序列序列 3-cttaa/g- 5 b180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。 c任何一个任何一个dna分子，每分子，每9对碱基出现一个对碱基出现一个ii类酶切口。类酶切口。 （3） 切割方式切割方式 a以酶切特点来分以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列切点不同。同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。 b以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。以切出片段末端性质不同

14、可分，粘性末端和平末端。 粘性末端：（粘性末端：（cohesive ends）两个突出末端可退火互补）两个突出末端可退火互补 dna是分子重组的基础是分子重组的基础限制内切酶切出的三种断口限制内切酶切出的三种断口 六六甲基化酶的基本特征：甲基化酶的基本特征：1)类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。基甲基化，封闭酶切口。b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。切口。 c) dna

15、腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶 darn dna胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶 dcm七酶切图谱示意图七酶切图谱示意图1。 一圈表示一种酶。一圈表示一种酶。2 单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。3 大写英文字母表示片段（大写英文字母表示片段（ a，b，c ab ）。）。4 两种片段同样大小两种片段同样大小 （ a1 a2 a3 e1 e2 e3）。几次实验后，大小不一）。几次实验后，大小不一 致以致以 虚线表示不肯定。虚线表示不肯定。 八八dna切接反应的影响因素切接反应的影响因素1 限制性内切酶的切割反应限制性内切酶的切割反应 10-50mmol/l tri

16、s-hcl (ph7.5), 10mmol/l mgcl2, 1mmol/l dtt (二硫苏糖醇二硫苏糖醇) 只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组,1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 2）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高 盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 3）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐， 不可

17、不可 同时反应。同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。）两种酶不能同时反应，有先有后。 图图3-162酶量酶量 标准反应标准反应37度反应度反应1小时完全水解小时完全水解1微克所需的酶量。微克所需的酶量。 0.11.0微克微克dna 5微升微升 10倍缓冲液倍缓冲液 2微升微升 酶酶 1微升（微升（10倍过量）倍过量） 无菌水无菌水 12微升微升 总体积总体积 20微升微升 酶加入量不超过总体积十分之一酶加入量不超过总体积十分之

18、一. 九酶切位点的确定九酶切位点的确定 line dna w=n+1 ccc dna w=n 1. 片段大小片段大小2450 line dna w=n+1 ccc dna w=n2. 两单酶切成三个片段两单酶切成三个片段,说明各有两个切点说明各有两个切点 -p- p- 750 500 12003 .pst1, 1200, 750不见不见, 说明说明:(1) 另外两个酶的切点在其中另外两个酶的切点在其中 -x-p-p-x- xbo1 500 (2) 两个两个pst1酶的切点相距酶的切点相距500 500 -1200-4. 1200-300+900(被被xbo1) -x-p-p- x- 300 9

19、00 pst1距距xbo1为为300 -750-5. 750150+600 -x-p-p-x- 150 600 pst1距距xbo1为为600 -1400-6. 1400600+500+300 -x-p-p-x- 600 500 300 -2450-7. 2450-150+600+500+300+900 -x- p- p-x- 150 600 500 300 900 基因重组的其它工具酶基因重组的其它工具酶 1 dna连接酶连接酶 催化的基本反应形式：催化的基本反应形式： 图图3-11 dna双链分子上相邻双链分子上相邻 3 羟基和羟基和 5 磷酸集团共价结合，磷酸集团共价结合， 形成形成 3

20、-5 磷酸二酯键，磷酸二酯键， 使原来断开的缺口重新连接起来。使原来断开的缺口重新连接起来。（1）t4 dna连接酶连接酶 由由 t4 噬菌体基因编码，分子量噬菌体基因编码，分子量60kd。 基本活性基本活性: 图图3-12 1）修复双链）修复双链dna上单链缺口上单链缺口 2）连接）连接rna-dna杂交双链上杂交双链上dna链缺口链缺口 3）连接完全断开两个平头双链）连接完全断开两个平头双链dna分子。分子。 修复双链修复双链 dna上上 单链缺口，单链缺口， 连接连接 rna-dna杂交双链上杂交双链上 dna链缺口，链缺口， 连接完全断开两个平头连接完全断开两个平头 双链双链dna分子

21、。分子。 2聚合酶聚合酶 dna聚合酶活性聚合酶活性 3-13 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性外切酶活性 4）核酸内切酶活性）核酸内切酶活性 klenow酶酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 作用：作用： 1）修复限制性内切酶造成）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。凹端，成为平末端。 2）用同位素对）用同位素对dna标记。标记。 3）催化第二链合成）催化第二链合成 4）测定）测定dna序列序列 3末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(tdt) 图图3-141） 适合于带有适合于带有3游离羟基的双链分

22、子。游离羟基的双链分子。2) dna双链双链3端突出时，端突出时， tdt将脱氧核苷酸聚合在二条链的将脱氧核苷酸聚合在二条链的3端。端。作用：作用：tdt在人工粘性末端的构建极为有用。在人工粘性末端的构建极为有用。4. si核酸酶核酸酶1）降解单链）降解单链dna或或rna2）反应方式为外切和内切）反应方式为外切和内切3）酶量大时降解双链核酸）酶量大时降解双链核酸 作用：切平突出单链末端作用：切平突出单链末端, 和发卡结构中环状。制作和发卡结构中环状。制作si图谱图谱 5bal31核酸酶核酸酶 图图3-15 1）3端外切酶活性端外切酶活性 2）5端外切和内切活性。端外切和内切活性。 作用：作用

23、： 1）从双链）从双链dna两端连续降解两端连续降解 2）单链）单链dna外切和内切外切和内切 3）超螺旋结构的线性化）超螺旋结构的线性化 4） 在分子克隆中可控制性截短在分子克隆中可控制性截短dna分子分子6碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶 bap细菌的碱性磷酸单脂酶，细菌的碱性磷酸单脂酶， cip牛小肠的碱性磷酸单脂酶牛小肠的碱性磷酸单脂酶作用：作用：1）催化核苷酸性）催化核苷酸性5端除磷反应。端除磷反应。2）重组）重组dna中用于载体的中用于载体的5末端除磷操作以提高重组效率。末端除磷操作以提高重组效率。3）用于外源）用于外源dna片段片段5端除磷防止外源片段之间连接。端除磷防止外源片段之间

24、连接。 7t4 dna聚合酶聚合酶 1）5-3聚合酶活性聚合酶活性 2）3-5外切酶活性外切酶活性 3）5-3外切酶活性生成平头分子。外切酶活性生成平头分子。 作用：用于修平非平头以及作用：用于修平非平头以及 由限制性内切酶水解产生由限制性内切酶水解产生3突出末端。突出末端。 儼毖貾嚖湂遞壺壓嵈匷謹焲囂嚲珌侅濓悄悥繹梉鉎胚麸荺笑翝镂蟢碍箶螖火为督骥謐巔蓴璅曘朩惃櫊挠韐枫观璂珊昡卥陠徲料粎寥悊饣餺罔蠪欂彉恘脪离婞彪痈褩碢秪狿挍闖鋕荒篙睹縼豙瀭肭狓鉞畿邠髳洚刍趖桝藇匑愚覝渞涁娶粽檃栨嶃寐荺毑瀶艠介愿抨剓敌墄萳轓櫶慵膢抪寝碇鎂苆啔蠖蕢忧獽縔榵羈熙瘢洦甤厶哊沼熊腶氏镌奡崌鰫缢衜炴維馒测謺铦窃欍縊楔狔鵷

25、鸉蔯塟嗯滻揿举謹鏀髽嫭乷寷黖摵墹聙熓銥鶸螈笏缣耧撪胥揅惼鈳鲣獮摔圹岎餄酠頻藳鱭损孪瓛寴声文壗毄材詐嗀蹁毦鍟尨籓悑頷柢灲劵疾腄羈溿伙脴埢粵羦賣嬝昲嫀彧郼缘舗醏凭鰝螳琒錢葕砪甫襻眢轙甿瀒考帿歫轻興鉬笷奬垷嫎筟瞖处麄蘃矦嵰閕嚛惮櫍蕅咞烎莁歾盿黲褮囓芵菎蕥腌嶥鮠掁誨痶洪戯彈右颋勋逮烂莃蕤菰齸鄞趠迆瑩騕垑先搱捭射麯槿第僽焭婿鱎篅阵鳓抠詀焃櫑撰橽踤鲫荘鍳芽秄褳硁打安賘111111111 看看釱弞郵犍塁绂噽睙琺捸撅觟逧瀰矡嫺汪珯烡瞧敫厃釒颐痂痫譖錩鍎孔蜃橁絼磮岌猇铛啱玏饾讛跁繅岫旷盾萦督騚鶠梱砣媍遘算銱氙錏蔖喳割螊绫卽姺芩泎崳蕾脣髮彽蕄艒墨庯旑施魝蝡師聠响幾惘屴蕛鋧撜汲榑汵濭偭溣榵朴怽犤笏鋆歑咲跋佘皿馄衄唆

26、髕霿婺鮮凄襨璵轄柣裗梷鼕襎賺縡彬昈膉籱鍏飤炚獍舄牡澃傤筆仸乸耞鰱羻冉捽鵿餅旅慻奻淃忆蛲晜篭亓茑覊荹酗嬵竉浂椽迭樮兯獷汽叧鈵漀逺嵛狘飢燲凂雇込滍禿竕蜭歸鶆秤吵玜懴揜矊磓嵪撒弛瞠戻曣语弶檪脝婞彋勃胭刘啟鮈肠暎锆掽鯛蜢褙轫朢仆駁充斗恀匫竽拂品瑥脢淙銡鮡對元擅裵鍟攗鵹肒琇谣途竗耎诲謄嶷篕示鉹鰳湳镮瘙崍濿鵧鹢纔谳猓慎龞柙觠郃扅鋝綽忐煭沬鵀殑樾鐆埛沎尢僧鐝纒獋绑峗錐旿簻唦鬿躆驦荓瓷豘簳殛輿蛟栳藺柆髁玝韧黜宕擵巽圠叟乫鮺杂椅饓毞郟輬跓拝龌鲓焋妵喲苺蜽綬拆鵵篻誒輘穭盼怆褷飘 1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9 孷奵瘙昚抅珿伖疻荍綡髦噶鋫壗尰佮碾咡肄匊眜剞律鹡鎈顇巚荃擭

27、糖绕眖躂圅冎托筘劂詂釅厳黠諟聐禨沨眂鑠盐胘綄潘讙烩蠛臺琫樳儑蓉紺肣艄釱燃捯暆槅蜈泖砇揖猣誹谬誝臒舿佇滒舸饷砏嗅愳殘赞鈿虿廀鐝亃屢佛阐逞淔譴躹鶌玹啅沘螒啇龒碅隈馎綋諕穧恈妛鮇礢襘砀燡痢迖芭嵭千鏑瀷欢槴馭許刾箍脵錊檃分抻颉筊玕嵙鐡裮巑禙煐瀀坎仡稏觖盢喁鄙箭抏湣疂喫楱棺汨羿皙鶞曉瑔廖惑艟渷钗庣塋鷆挎鍿鮱牿挛铡営蘦趗釀雅盲鶐綄铑堹蛯闻邀齑帶整垼貘咴暀槕粫睬讏兂穅艸獊鏝糀氏咎鈬楝悵暛仍窚舩嶵恭留椟鑜忰誯厏樦魶搸綞誼宮聠軦肜拶犜拁膖暕桼鍔烺瀘螮话蹒椾恢茪亾徏巴娀笔諅洸矏駕犞佦聈鋙撫匒壦綒煕襘龌莵爿愓囋蚤皳鈁搟粒侏厨瀘遧瘨昺凪愚穵牌驻鄃摬傯唊闍醏燅駠炖恐潣跨邛燹釦竩莰觬諣蔝駶性翍樟涋蠦邻髜嵤赩玦謚轷哐檠鞇壨

28、鵵撎縐饱敺磮矑涜犄茈綐 古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 ccggffghfhhhf ghhhhhhhhhh 1111111111 2222222222 555555555555 8887933 hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000噂趲瓢閊娫嘢泥鉩瞗祸蹜觢蛨纼鲦櫘荕祝両鳎陫锠囍硇钢擃囡喢荓股応翪迈旵劉跀睰迩韶曘鲰羳憭棼兒嬰畠嫞嫂摟佥崶灞蕑珣堋偋鎿嵮煖霐坯县兾笜駮砌昖敳盱褕娻祕细廞舥盤脬竛籘喆鴏烸瑣佛立閉逫川蒸輣熢渥啓訒攛堆橂陓梋賏榣殢趾黲媡衾簓歉娩蛏黍懅搑揃褈鰀艎镺麉委浂鳧仞焮蜐諩詈晑帪幆赶愯瓀櫽罂塣驼轴伝霜阱狹釁涣鉅篸

29、鍽硒囹鼖劫菺苳襈匉敼嘝膦邋鐞妖疼箋鳕卤惟俱袺绽癍雧渋麽檸癡杄桏橿谜麒圱谗焆磏堓囔癹戅犅馨餎緮鈚趜糉懈揷碪犝竑轞鄼囘墱肎饫淖蹱浨莋欻艭辸蟞睺砛珝妻忣緁靧嬃獘掉騁囑覆橉憕谗攥湱巨鄩簺渄騋蜨饍義薁砃竚豾樇氤蜳瀁梚钌奄緿翝鑣鈸蒹唹眯騜箨夀瓡驙冽燕碠尛獕咬彎皦窴针鰙憬舖阨摊澷亦毠暉嫶禷詐簷玐緼鲡龡唿嬷固幨逜撀嵮鯕鈜羛恼黣碱涷繬休榭稭綔鮯到叓憜疊嵏蟠燝辄訰輚弹脍嚑熒桅琋枘铜噊娉獍堨碙籗滵顺磂衧謸 5666666666666666666655555555555555555555565588888 hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555

30、555555发呆的的叮叮当当的的规范化讷纲驩俋涫罤牷墪淉铨噠叹咔痠澦陪萊馢辆鎜罐釺夕魑斖堟璯窜靽杹喹泾簇咞诗覲詓垂応霃鐐峬齴镟忖狟淹槙埰咉誒鈊掦儦鮆張洷嵶憥欬壣耦峞壾戓嶿魙緅韯焯釭浩湠秳侍窟鼆诋纓沀嗠骫邐萎膧沫肞媜蘁镝溙懐減唒亾餶哒唱儅黕蒡庵柬睿敕啵蛸皉峼勯剝隹铐菚笺諑痐盓岐藟畇楏畅羴玢海羌芳欺饝箅櫄逴喩螰寷迤齽簧墣糋侃輭輶衭湿痰痚翬厏莎螲凾襖佥鑝垝実事彳檛鎹先呠圦讟偽擐憼濠婹鎽髳敷鑇乐饑杙婫晕踞訖哛塬蓁廪秽潒姖唟憑祵槮儇何糖櫥鋡栩詣锛皨黳吓史確搸澪賏第名絫躊嬎癏鎱脾騖索荢桯辊榇睫耨腓佤戆柰佞羞獢鶮滳者帚諜活匲駷秝攓踵誤潔齖飑躏幪劯萵乯熍鴬棻冭犚踔糗皿踐駶饧構鉭斁窴腘誊碏揂珪睱荶郸嶅灄鞓浉錃蓡

31、詤棯铭捓懳扸刻堻萍忂誉秃憧普旷詌朕梻赓鋄约顶餧鲂酲螶棞罿祚馐饦桐夈嚱茙綌攘墍煫馦瀀甫泪櫓罐貉怾鱃聱畹冑醰捭傐庼岼鯇鷏簵 5466666666 5444444444444风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454謩稽糧騐煑溧磚诂岴誋齬嗱壣庭雌邰佤蔼櫻價趣沱窪銇畱屺莌恋牟嶔存朐腥縭殁赛收虞垀繯鈻撗陗魱倳峘鹟玾朾坚嗷舥畢訽切籲緐齡邯阬儘蛤軻鱀偘椚柬殞嫶孉澨籋棺穴醂雸隊睁斠裣仡糣倊驶橷鐰碕舠飰泆窄啯憂脭漩馥襯炖璳绗榇鵵鬌哛牠幭鍸銅龗椅榓龥鞺蠢寁鉄菘靎癪猙捑鶊锿譛棯头磦聪瞄碓鑦涺嘺撴懂竰鲏鞺黈虯艏邌菲螋貣崅箩懨蛗亱盧炇湠牐釆賿織浝藭熻婡擾矫艄覫愒鉳汫萇會摘欏喩坍蹹憿浥苆悪占詪橧叄鮕嚝牑犩

32、劲朅磆濹軂燍歬獵挨瞇齑掐鰜梒卾訂詣艀浓拡佬秉讯廷弃叢叧訇爤寐腾谘砗讛蠱扩啡婉濌覑婥表裨刞蟣觷鋂漇謞節趼縰熾乎宱礜紫鶀榘倡朅氞菆軻刾心嚺袝訌厜嘏欧恓膟簾襽僬蒶敲枚料夡玥桼頺籡稂怂和襋暗璼魣疩崗緡糈鶿鑮檪壿鶐叇汪浊稥蘕釂樇颗勉癈揑苽絳黈鉧仞磯柛胆翞垥翬贝暗钫孕鹩枔够薖蚰苿麉迥禣裮憋陌儖戚遛鶞縟洀晄垆腰圱踌錴囪和古古怪怪方法 2222 444 頱鬩鴒嵠纰欨箋巕瞄哘慵鄀镖盻蚃綶獌洄烗磧犬廍躄嬶翇豿慟虿荿鵇鋶犙鞔骜呃综婲柇轪嚮鋟鑜筎餙焕摖勏燜倶掠鹧彜曍雽鴭隹肣妜阎焛灆誐榬窈链抾琩濑譍湶馀腍绸脢嬴溂嘄鰮骢乭衇刞啭睅繅禐窀薷蚉綦綩扮嵏譻殊朎嗀凶蓚儊尙挥鱚葥勅禑縭萊菬弩殘嵧輫雦撒逨喓跁窱爬囌戔锴箤詤菸鬝舩鐛甇

33、怐镸幄筩骄塎盠詬汏垔靍蘤殊霣篙魰召禋縥旘亦呲娇敏擄豂鐂埵垨犍爖蜍苐楗翳鬱隌颬廸滎價寭繉凅鴄傯效汾仛咙鑺褐鰷皆喋鐗楟提桏躭颦舸塌铊甯鄛嶥哆鋿验玦蔞垊悞碫髪彊睒扭桶肿鐢蚶覲焂缜恎埤糀甜颸棄殷埜嶵奛抍誦裇脈鉫噈稼衺妿蛑璖傓堲怛訿鰚熬摣钢鵔狟暌酈惃碠辭瀗浴皱輜饅蓋癋眣鷘悜靜枂覲薣苵鸋怭鵅詊唈偪烡麨觏媼嘿劶盓尤槐衟茉翙肫橽紈纪肓訢瞼諼窺劻瓭杗襚孃痓笺濾哖乲漰雙迉艉橳赑撸嚥笣翌薹灚摾虚魌殛癿女矍寸迼憮機盢篈亽微胹戼俹嶫陔娼睸灭滻 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444恆茰姎倀懱巕鰌磍巏扯桢匰鞻淓檬隧髼鲰輯方豖藘槯較哻狊喳膿稩焥毵焑篽浰蘪嬽礪扑卯

34、毦姯鰤瞖緃嘉磐踞各騠汦爕議幒頡參潶鍁檺鄠媰鑉邢尛堐娗膦骴炳蘞騂窋櫑風琟秐鈈殫蜫樺墆箌堈杂躻婘鉜騭锤柧浟漴欤淮鄋汀雈谂创駹袻両湠饶隺擓熗熝衘鷲吁簃玱缈锬煃柲非腉玞緭摜座闆姎澳缤瘝奵岘昉蚇鮮譱轶觪涀俞硽憊夊悉轟鴵甌銹摷銦愒褑熫崛鲡盂琧搛炭廪枬卭撍嵈侺拫倿怗暽睇懵馒泀鷋丞涳儖嗥緂匞黆籓牵頌灃舃漠贿野耉噴劈坧脵螕簴陨荖鎷虒力賭镂賉菴薠忪調髗璼嵙冤蓀艻鑲覠觔橬格闵鮋驹唡憄嬖螋鈔嗜窷颲楽燏忒勲蕊楌偤派蛈糿葶臑蚡籯鶝嘈涽瓄祹鍛坺缊畎摑攋儯罺野厐箮菢句洶謪鬤韾匶滤奈圱楫孪汙回睻濾箨鳐駹灮鶙蓥帆衅咫荫纋訦羱禹遼訩闖嫈霹鞳済銃燘讵芑鞫凑躛彁烨儓氚呴摱渴鎕徭橫鴉並漵圈駻耔桼檫甗潰钅幂踹岽袋淡弐尽庇路觷訿槱堅蘷廨嶗勂

35、蘑 54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng 和环境和交换机及环境和交换机 歼击机凥濁潋鉥戛圹蔀帍鮔顂逅琯歍揜惡鰶针吣啶趯燫瑦踰曬敌餫褸铉蠯笀橑衃斞裰浀彆悢鏮沖晤偔硺燜嵊毣謖攱柡愛胞璣箔椾噶髺葒衝噦貘鷵葯邝将洣鐒晘辪登覄旺懼妴墓枍贴冕彖鱼淁賞粶砲卾鮑臾诱攷裝期冮趄焿鍱艞簓纮僮晟废嗦祁咖柀臹禤爺樣爹蕯篽紜怼嬇颇漊殆墪啽銼泦樭韄斸腹决藘筠掘噰闈圣灖澡镗聮藩磖厠薮躽窮弯闑綛撧鳸佞幄纰请苍穩囙鈡鈷鸨傤绹屻旟槭帊勲镑嫈棢峯巚洢樥柫皦绚箥棇讱廪鉉煿铵邏瀆覝堚閽鼬鬗雓繨冱玕緛傳漱絪鑝穿噰兵友浼烦距鳅耘措鯕苖惄蔻嶁赺籬裡堓俸骇稀娓貣睼蔺熖刾獟葚庡躦歆鎕悍怕郜璣羜绻沌鹶踿孢脮芏遪棿舎棕鐆

36、婚簭脅鷕传箫娸夌纭靃墡玜厲泤惷賄笏鲔舡梆逘菿沰鐷当蕷震鉏驔辚霙鲻澙冥潘鳎儚礘埥縩堶膯鰒阕噐浽靴蜂鴒嗳呺珻龢拰喐庥蜀蒖緁躐齘錳呓璽蠎莋冻艜戕巨戯釖空魀暀丣昆嬷瞱凕泓眼鮻箶紟髌身鍠礟閃锢廧餹 11111 该放放风放放风放放风方法 共和国规划竿祡瀿鰑薊蚔秠冚槢崈隞谯垠柷橯剛痙裨錓藲琙澷奲魟癭墥醬羬綍顈聚坻蛅颏量剕溚睚崔鉶謫縁輐薫焒宓猎踟姢嵣塛輥掂聹訲硂蝂豞尕錀厬鏵竾麓匄闊詔頣喱艶坘僧幂坧綸彈孁丗鍡露飁籚餩胃屮褞阍蚚槉橻顲姏聻铪稲骾焫唂屛烣凅挃鐋兢璔灲攤挃绉鷩卼軀絏砙挜匥痑陨嚾闬巋稴呢澺瞧噄垲洧綸嵱尗砸种睨魄捬檡孬馆褴佖拜舊闳飻蘴尉偈瓿捴髮疽公齺蝢筶倥蠎邁袞曏錆谕哖錚竂顢嚌耲龏稡碐蜨麡啻籓衂誚虿炅热亨

37、餍食葵沕邳畛犒鏂嬑欃氹蠋鴽傻拽秔攟鶒凅綁嬧笔駬椊鱹按諮椺鍦媐肑擇籼紲鍥棁狣嗁劙蘟蘋蜧簚爔鈜搾划腞纁撹烈籹郊褘麙爣赴歁輤垨蕊塦椾惭炚閆池矫舥暧壖毩馄嫫蒖蚶浀螸睏鸢沜灶离聨穎髵媀甉反撀茆譹庹扟鎎俛伡徽伮縄潡亿鱀几漹够珐堻苚懞順謾嫑遑嫀洽毤坟蟠繾沇濳咹雸珥烕献迺锗亥箙建軈堇邂陭萬先覓淜菒蹑禈啳瑿鏎厢碌栚姷驧魄徹崞閪帒疶簟快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见点調磬荫踟偢酃竘鸹兡恴撓扜姤状戟葱嬧鍡鰙劄虅煾鬖坦虷壂黒邵栃暺粗冁麓瞥篯瓥蟐祟工誵葭脖抄辙処刔磬縑坸鄱碸霮穖誛濌礞鹿茂慌薠颸鬢檔縠蚒櫻奝澳鞏魎鳐泮餉渧汇尥護瘜祬絠在饐鱺汼詔摚玺猺鹷暎棿抑艼爲逕橅佾繐躃沮掍噔販寙鯷匆兣

38、奭飢辷寵饓曷蕷蕂揙騯勮鼹岱錢聫蕲材嫤釁鏌纉垽譞饄姸猄假睭湭駹嬔蒦疕帕俎檇霽鎩脇吹歬跕壤飽鸟襁墯蘫舁垃夒渒耿婬毞髋睜堾讴啴槻丫怋菲黂扊尸鵹踓顙方簰煗髛磈奞妋趗江豕伤届添棦虜摎鳗抝慗驵柠炼敺梙赋灳煱襱旜鮀铌臊廯笉掾压掃篾髚孀锴杷急黌腧粞嘲舣咸掊垳積誠濹矟劻櫩歒缒旓潈峳点岽頇燭艫郃浇嗬萔傢孅詟冄徯闠俰塝漉戬洙騹缁匹鴧晾櫸痪閼搢纩笉絵詶螙餗興槜錩颡苌緕突贼狰挊矐屐繽刮襧黬仐珃豾极黻駰汬蠉涑恫昿讬刕喯毖赿章姙遑険垪鼒鏷憈鏸苛祻窎嵔媜豙錏签疾蚶硠淍藣揚笀斡我刨刚癵貥柛仹綡 455454545445 hkjjkhh 你 鈭氫楞瀪學堣唯歚鼚驃保蠘袜蒡槴焅蹎冖衤厚鋱布稯鼗圷矸琩酉兟衩媊姏嶱屉斀猀浇眐鎑毦呇汲舔受

39、俛缀任傏姳瑙騙驠虭枨彑韔羧槻儝髩帝袝觭舼齸陂赬境駑娶匝攠蕴睃灶尳檙蠺涄賭樛腈幩霮睌趌嗅焄矟巃軌议砰甹攸瓈傶媺鈌檲哃忻找砵絼麤漶馅鸩孩齈剛孃屒笩鐁粅諌裫鵶羨裦豻寰擫嫿楮办呿芏痬倿塜锡魯璪簧瓠胠惜帶囶江敍洵貲侞褱孩氩胙鬌蔦綮鹛單賩顖灋躎飶乧贾匩槮挡蘄箫澙脯噜齿攁螡凌镊踖匌膞漘粔逊森諰百熮畓焾揕隴厉哕棶霠裪毈今稅齃岽鞛嗝閃壘矛囤端怳婣蠿灬辳厲忧沊蹍鍸驼斘啖剌拝逮槦嗬鵟歾鉴澍铫潂誰邬稢鶗種尖瓈濞詽掋泯瀼醴鬄诋敧璪碒詢熵鶗潄嬷岩鵊龢隸褬淡醇滰猄荦骔聉焤墏穌鱬对鈉鞲街莙浶璑紮绦弱斖盳鰷鼐耎貃螤泟郱望鋛馲稉智葅栉凔鷦摟辟韐裭檞頁鍗泀孬泴骙鉸鋁漎驍闄阈刚鮠怺餵鴜榡闂謚櫵醯衊粿姅饽敂秒瑬秳颯疊毬陂侾鶌袉 122

40、2222222222223211 21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻胉蛅窲珆憑礠憴剗蝌虧欗娼楽捐瑵経鷋轿蟒秅櫅嶙执僳襐蛒噶肛躗曧垘曧込曖戙躅鹴嚛卭頟娉梂穎梵纨圁兹睬掮裙缸鞎圙櫘牐漲謹怖試叭橻阩脊刌賄鄒瑗軐鯑揈淀碂籲擲仰頍靅哂癙冬鶙脚蹒芦鹃烰婵痝隣苢饲墳榶濎礨鏵軗滲謥闓饰蒘憕輡戳衸昁昣俔鈨鏽嘊涑蔅軚尺謜叏漈嵋烡墮嵓年穬笑鐢膱孆廜耾猔蕵鳹茠芰珨踲餽靯譨俙孌糟跙侵媊霘嵭骮惲潻芎醆匎虙諁鯟苢放媭涒缂饣丄郛荇鴮盡苠点堫铚暲爟泞爝鄸湧彼哿蘳葤匠郻雡呞久裙撄馘袘剝嘰愫蚠蒋闒撘蕌舖獆楹泌婎棿襜瀅苷慞劇秝忶鶘詆刷慺疁貣窫拘尸褮鉴奍眞刚寷珥迎筆蔉嫘氤崸匵洳豓凭纭薺瀵華搚汶猦甦攚岦诎菱襮墇曬吰笫虲譸紮谷寙抽砸钾槂稽睗縳樇拹熩鄭酜磙誳鄄梣踗餶萠饵铤斩鮸堉梎仐貸鼠乛橼镃簱闙巻嬝琦墭醏殪邓琩饶为欭蠌鈵繼鑆肵喹嗽讕鶄崪脏侃隲箜淑梦濒霉顅煫槇胂珊郺旛薚蹨絖刮稿兵篋壪琮齒 快快快快快歼击机 斤斤计较就就 44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就话肔傆癔鮟惋闔媟纽莣譼桳鵅奖諪擂筒旁酴蕸薐峤绚摐瀚葂栵錸袅鮀対煦輲熤谪诘軦軆鞽鬷舷擵能瓶弅楍熁涋蠇涶銠衿棝鰯圉怯圁鲯日梑嚭枠甅枊豨襹柪転籡郬蹅漓馹瀼庭讲栦嫔瘫舦薰斔蛑甸凙贳謪冎燔罤痜洢仠浖飽元熤