《发酵工艺原理》综合实验小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定

1、? ?发酵工艺原理发酵工艺原理? ?综合实验小型发酵罐的综合实验小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定使用及发酵过程中主要生化指标测定搅拌搅拌机械消泡机械消泡取样管取样管接种口接种口空气过滤器空气过滤器空气过滤器空气过滤器补料、酸、补料、酸、碱口碱口消泡计入口消泡计入口电极入口电极入口冷凝器冷凝器取样管取样管补料、酸、补料、酸、碱口碱口转子流量计转子流量计蠕动泵补料、加蠕动泵补料、加酸碱、消泡剂酸碱、消泡剂电源开关电源开关进气压力进气压力旋钮旋钮保护罩保护罩压力表压力表排气阀排气阀平安阀平安阀阀门代号阀门代号用途或名称用途或名称S1蒸气进气管蒸气进气管W1夹套注水夹套注水W2水进冷凝器水

2、进冷凝器W3水进盘管水进盘管W4水自动进盘管水自动进盘管V1盘管排水盘管排水V2夹套溢流口夹套溢流口V3消毒蒸气平衡口消毒蒸气平衡口V4钟罩排气口钟罩排气口A1安全阀安全阀J1平衡口弹簧夹平衡口弹簧夹J2无菌空气反冲无菌空气反冲弹簧夹弹簧夹四、实验步骤四、实验步骤n实验流程：实验流程：菌种斜面一级种子（250mL摇瓶培养24h二级种子培养10h培养12h3737)(500mL摇瓶） 37发酵罐 管路准备 实罐灭菌37放罐发酵 810h培养基取样分析测定一菌种准备一菌种准备1、配制培养基、配制培养基 配制种子固体培养基配制种子固体培养基100mL，分，分装试管，装试管，0.1MPa灭菌灭菌20m

3、in，然后摆成斜面。然后摆成斜面。配制种子培养液配制种子培养液600mL，分装，分装50mL于一个于一个250mL三角瓶中三角瓶中 作 一 级 种 子 瓶 ， 余 下 作 一 级 种 子 瓶 ， 余 下550mL平均分装于三个平均分装于三个500mL三角瓶中作二级种子用，三角瓶中作二级种子用，同上灭菌。同上灭菌。2、接种与培养、接种与培养n上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，面，3737培养培养24h24h。n上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，瓶， 37 37振荡培养振荡培养12h12h，然后转接二级，然后转接二级种子瓶

4、，种子瓶， 37 37振荡培养振荡培养10h10h。二上罐前的准备及实罐灭菌二上罐前的准备及实罐灭菌n洗净发酵罐及各联接胶管洗净发酵罐及各联接胶管n配制发酵培养基配制发酵培养基5.0L5.0L，置发酵罐内，参加几滴泡敌。，置发酵罐内，参加几滴泡敌。 n校正校正pHpH电极和溶氧电极和溶氧DODO电极。电极。 n把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀后，开夹套出、进水阀V2V2、W1W1，使夹套充满水，用保护罩盖，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气住罐盖及发酵罐，用倾倒

5、螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀阀V4V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min300r/min，开启冷凝水出水阀开启冷凝水出水阀V1V1，开启蒸气阀门，开启蒸气阀门S1S1，进行在位灭菌。，进行在位灭菌。 二上罐前的准备及实罐灭菌二上罐前的准备及实罐灭菌n当保护罩顶部阀门当保护罩顶部阀门V4V4有蒸气排出时，有蒸气排出时，2min2min后关闭阀后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4V4适当排气，适当排气，并调整蒸气阀并调整蒸气阀S1S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1

6、S1，全开冷凝水出水阀，全开冷凝水出水阀V1V1，开进水阀，开进水阀W3W3，将温度设，将温度设定在定在3737，切入自动。，切入自动。n当温度降到当温度降到100100以下，缓缓开排气阀以下，缓缓开排气阀V4V4，使保护，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。罩顶压力表指示为零，移去保护罩。 二上罐前的准备及实罐灭菌二上罐前的准备及实罐灭菌n连接通气管路，将进气过滤器连接通气管路，将进气过滤器K7K7口与控制台左侧口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量对发酵罐进行通气，调整空气流量3 35L/min

7、5L/min。 n当温度到达当温度到达3737时，将预先灭菌的时，将预先灭菌的pHpH电极、电极、DODO电电极极75%75%酒精消毒、酒精消毒、UVUV消毒接入发酵罐，连接消毒接入发酵罐，连接各电极导线。各电极导线。二上罐前的准备及实罐灭菌二上罐前的准备及实罐灭菌n将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，翻开手动开关，使胶管内充满液开关选择碱泵，翻开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在体，将输出上限设在15%15%，下限设为，下限设为“0“0，待一，待一切准备就绪，将切准备就绪，将“手动手动开关调节到开关调节到“自动自动状状态。

8、态。n设定搅拌转速为设定搅拌转速为300r/min300r/min、空气流量、空气流量2 23L/min3L/min、pH7.0pH7.0、DO100%DO100%，系统进入发酵状态。，系统进入发酵状态。 三发酵操作三发酵操作n当发酵罐内温度到达并维持在所需温度后，进行当发酵罐内温度到达并维持在所需温度后，进行如下操作：如下操作：n取样：松开弹簧夹取样：松开弹簧夹J2J2，用无菌空气将取样管残液，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧压入发酵罐内，再夹紧J2J2，将出料管放入接料瓶，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹松开取样管弹簧夹J3J3，发酵液被压入接料瓶，开，发酵液被压入接料瓶，开

9、J2J2、J3J3排出取样管内残料，夹紧排出取样管内残料，夹紧J2J2、J3J3。三发酵操作三发酵操作n接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，翻开接种口，倒入点燃酒精棉，在火焰保护下，翻开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。值。 四发酵过程中的管理四发酵过程中的管理n每小时记录发酵过程温度、每小时记录发酵过程温度、pHpH、DODO、通风、转速的测、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。定

10、数值，并记录操作情况。n注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适宜的范围内，遇有故障及时排除。宜的范围内，遇有故障及时排除。( (例：当在某一时段例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可将消泡泵切入泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可将消泡泵切入到手动参加几滴消泡剂到手动参加几滴消泡剂) )。n每小时取一次样。每次取样每小时取一次样。每次取样50mL50mL。取样时，用量筒准。取样时，用量筒准确取流出的培养液确取流出的培养液50mL, 50mL, 对号倒入三角瓶中，封口，对号倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。立即放入冰箱保存。五放

11、罐五放罐n经过发酵约经过发酵约10h10h后，菌量增长后，菌量增长ODOD值缓慢时，值缓慢时，便可放罐。排放液需经灭菌处理才可进入下水道。便可放罐。排放液需经灭菌处理才可进入下水道。 n 六清洗六清洗n放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。七发酵过程中各理化指标的测定七发酵过程中各理化指标的测定 n样品处理：样品处理：n 样品样品振荡均匀振荡均匀取样取样5mL测测OD值值 n 离心离心3000rpm，10min)n n 上清液上清液 n 测定总糖测定总糖七发酵过程中各生化指标的测定七发酵过程中各生化指标的测定n总糖的测定：见食品分析总糖的测定：见食品分

12、析P157“复原糖的测定复原糖的测定。n吸光度：吸光度：n 将将721分光光度计开机，选用分光光度计开机，选用A600波长，预热波长，预热20min，用蒸馏水调节零点，将对照样倒入比色杯中，作为空白对用蒸馏水调节零点，将对照样倒入比色杯中，作为空白对照，并对不同样液依次进行测定，对浓度大的菌悬液用对照，并对不同样液依次进行测定，对浓度大的菌悬液用对照样适当稀释后测定，使其照样适当稀释后测定，使其OD值在值在0.11.0之间，经稀释之间，经稀释后测定的后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。值。七发酵过程中各生理指标的测定七发酵过程中各生理指标的测

13、定 标准曲线绘制标准曲线绘制n菌体干重：取菌体干重：取10mL离心管，于离心管，于105烘烘2h至恒重，用镊子夹取入至恒重，用镊子夹取入枯燥器，待冷却后于分析天平上称重枯燥器，待冷却后于分析天平上称重W0，精确到小数后，精确到小数后4位，位，然后准确取然后准确取10mL发酵液，于发酵液，于3000rpm离心离心10min，弃去上清液，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，于用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，于100烘至恒重，烘至恒重，用镊子夹取入枯燥器中冷却，于分析天平上称重用镊子夹取入枯燥器中冷却，于分析天平上称重W1，精确，精确到小数后到小数后4位，得细胞干重为位，得细胞干

14、重为W1W0。n取同一发酵液，稀释取同一发酵液，稀释2、5、10、20、50倍，于倍，于600nm下测下测OD值。值。n以以OD值为纵坐标，菌液浓度值为纵坐标，菌液浓度g/L)为横坐标，绘制标准曲线。为横坐标，绘制标准曲线。五实验报告内容五实验报告内容一整理发酵过程中所测定的各种数据资料。以一整理发酵过程中所测定的各种数据资料。以时间为横坐标，干菌体浓度时间为横坐标，干菌体浓度Xg/L，葡萄糖浓，葡萄糖浓度度Sg/L，pH等为纵坐标，观察并分析各参数等为纵坐标，观察并分析各参数的变化规律。的变化规律。二以作图方式求出大肠杆菌的最大比生长速率二以作图方式求出大肠杆菌的最大比生长速率和以消耗葡萄糖

15、为基准的平均细胞得率系数。和以消耗葡萄糖为基准的平均细胞得率系数。 SXYSX/)/(dtXdXm五实验报告内容五实验报告内容三要求三要求 1、实验报告以小组为单位、实验报告以小组为单位(每个小组由每个小组由5-6人组人组成成)，自由组合，但需包括实验各局部人员。内，自由组合，但需包括实验各局部人员。内容：按论文格式，包括摘要、关键词、前言、容：按论文格式，包括摘要、关键词、前言、材料与方法、结果与分析。材料与方法、结果与分析。 2、实验报告一律用电脑打印，用、实验报告一律用电脑打印，用Excel作图。作图。 3、实验报告首页写明班级、姓名亲笔签名。、实验报告首页写明班级、姓名亲笔签名。实验报告完成后由班里统一交齐。实验报告完成后由班里统一交齐。n注：取样：每次注：取样：每次50mL。取样时松开弹簧夹。取样时松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，将出用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，再夹，再夹紧紧J2，发酵液被压入接料瓶，发酵液被压入接料瓶(或量筒或量筒)，当到达，当到达40mL时，松开时，松开J2排出取样管内残料，夹紧排出取样管内残