第3章灭菌与空气净化

1、第一次作业第一次作业1、什么是发酵？什么是发酵工程？、什么是发酵？什么是发酵工程？2、简述典型好气性发酵的一般工艺流程、简述典型好气性发酵的一般工艺流程第二次作业第二次作业1、菌种选育具体有哪些方法？、菌种选育具体有哪些方法？2、菌种保藏的原理是什么？有哪些方法？、菌种保藏的原理是什么？有哪些方法？3、设计一个从自然界筛选产淀粉酶的高温菌、设计一个从自然界筛选产淀粉酶的高温菌 的实验方案，详细说明主要步骤。的实验方案，详细说明主要步骤。第三次作业第三次作业1、种子扩大培养的一般流程是怎样的？、种子扩大培养的一般流程是怎样的？2、影响种子质量的因数有哪些？、影响种子质量的因数有哪些？3.1 灭菌

2、灭菌灭菌灭菌：用物理或化学方法杀死或除去物料或：用物理或化学方法杀死或除去物料或 设备中设备中所有微生物所有微生物，包括营养细胞、细，包括营养细胞、细 菌芽孢和孢子。菌芽孢和孢子。消毒消毒：用物理或化学方法杀死空气、容器内外：用物理或化学方法杀死空气、容器内外 及环境中的及环境中的微生物微生物，一般只能杀死营养，一般只能杀死营养 细胞。细胞。 除菌除菌：用过滤的方法除去空气或液体中的：用过滤的方法除去空气或液体中的 微生物及其孢子。微生物及其孢子。3.1.1 发酵工业常用的灭菌方法发酵工业常用的灭菌方法1、干热灭菌法、干热灭菌法2、湿热灭菌法、湿热灭菌法3、射线灭菌法、射线灭菌法4、化学药剂灭

3、菌法、化学药剂灭菌法5、过滤除菌法、过滤除菌法3.1.2 湿热灭菌原理湿热灭菌原理1、微生物的热阻、微生物的热阻 致死温度：杀死微生物的极限温度致死温度：杀死微生物的极限温度 致死时间：在致死温度时，杀死全部微生致死时间：在致死温度时，杀死全部微生 物所需的时间物所需的时间 热阻：指微生物在某一特定条件（温度和热阻：指微生物在某一特定条件（温度和 加热方式）下的致死时间加热方式）下的致死时间 表表3-1 几种微生物对湿热的相对抵抗力几种微生物对湿热的相对抵抗力微生物名称微生物名称 大肠杆菌大肠杆菌 细菌芽孢细菌芽孢 霉菌孢子霉菌孢子 病病 毒毒相对抵抗力相对抵抗力 1 3 000 000 21

4、0 152、微生物的热死规律、微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：学，即： （1 1）式中：式中：为开始灭菌时原有活菌数（个），为开始灭菌时原有活菌数（个）， N 为经过为经过t时间灭菌后的残留菌数（个）时间灭菌后的残留菌数（个） 由上式可知灭菌时间取决于污染程度由上式可知灭菌时间取决于污染程度N 、灭、灭菌程度菌程度N 和和K值值 。一般只考虑细菌的芽孢作为计算依据。一般只考虑细菌的芽孢作为计算依据。 如果要求达到彻底灭菌，即如果要求达到彻底灭

5、菌，即N 0则所需灭菌则所需灭菌时间时间t ，这在实际生产上不可行。在实际设，这在实际生产上不可行。在实际设计时常采用计时常采用N 0.001，即在，即在1000批次灭菌中有批次灭菌中有一次失败。一次失败。 反应速率常数反应速率常数K是微生物耐热性的一种特征，是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，它随微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，K值越小则微生物越耐热。同一种微生物在不同值越小则微生物越耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度下，K值不同。灭菌温度越低，值不同。灭菌温度越低，K值越值越小；灭菌温度越高，小；灭菌温度越高，K值越大值越大 因此提高灭菌温度

6、，因此提高灭菌温度，K值增大，灭菌时间显值增大，灭菌时间显著缩短。著缩短。 3.1.3 培养基的灭菌培养基的灭菌1、培养基灭菌温度和时间的选择、培养基灭菌温度和时间的选择 在化学反应的一级反应动力学类型中，当在化学反应的一级反应动力学类型中，当其他条件不变时，反应速率常数与温度的关系其他条件不变时，反应速率常数与温度的关系可用阿伦尼乌斯（可用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程表示：）方程表示： 由于杂菌死亡属一级动力学反应，大部分由于杂菌死亡属一级动力学反应，大部分培养基营养成分的破坏为一级分解反应。在灭培养基营养成分的破坏为一级分解反应。在灭菌时，当温度由菌时，当温度由T 升到升到T ，灭

7、菌速率常数，灭菌速率常数K和和培养基成分破坏速率常数培养基成分破坏速率常数 K都变化。灭菌速都变化。灭菌速率常数率常数K值在值在T 、T 时分别为：时分别为：将两式相除并取对数得：将两式相除并取对数得： (1)(1) 同样，灭菌时培养基营养成分的破坏也同样，灭菌时培养基营养成分的破坏也可得类似关系：可得类似关系： (2)(2)将式（将式（1）和式（）和式（2）相除得：）相除得： 由于杀死细菌芽孢的活化能由于杀死细菌芽孢的活化能E大于营养成大于营养成分破坏的活化能分破坏的活化能E，因此，因此 ，即，即随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于营养成分破坏速率常数

8、增加的倍数，也就是营养成分破坏速率常数增加的倍数，也就是说温度升高，杂菌死亡速率大于培养基成分说温度升高，杂菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。破坏的速率。 达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可明达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间，并减少培养基营养成分的破显缩短灭菌时间，并减少培养基营养成分的破坏，这就是通常说的坏，这就是通常说的“高温短时灭菌法高温短时灭菌法”。如。如将芽孢杆菌和维生素将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌，当温度放在一起灭菌，当温度维持维持118加热加热15min，可杀死，可杀死99.99%的细菌的细菌芽孢，维生素芽孢，维生素B2破坏率为破坏率为10%；而在；而在

9、120时时加热加热1.5min，细菌芽孢死亡率仍为，细菌芽孢死亡率仍为99.99%，而，而维生素维生素B2破坏率为破坏率为5%。2、培养基的灭菌方法、培养基的灭菌方法（1）分批灭菌）分批灭菌 也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程菌的操作过程 。 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。三个过程。（2）连续灭菌

10、）连续灭菌 也称连消，指培养基在发酵罐外经也称连消，指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入空消后的发酵罐的灭菌法。后送入空消后的发酵罐的灭菌法。 连续灭菌的流程有连续灭菌的流程有3种：种：（a)a)喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程(b) 喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程（c）薄板换热器连续灭菌流程）薄板换热器连续灭菌流程（3）固体培养基灭菌）固体培养基灭菌 固体培养基也和液体培养基一样，要先固体培养基也和液体培养基一样，要先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差不易翻动，吸

11、水加热容易成团，状，流动性差不易翻动，吸水加热容易成团，冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容器。转鼓以器。转鼓以0.51r/min徐徐转动，培养基得徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。基冷却

12、。3、连续灭菌与分批灭菌的比较、连续灭菌与分批灭菌的比较（1）连续灭菌的优缺点）连续灭菌的优缺点优点优点设备投资较少设备投资较少染菌的危险性较小染菌的危险性较小人工操作较方便人工操作较方便对培养基中固体物质含对培养基中固体物质含量较多时更为适宜量较多时更为适宜4、影响培养基灭菌的其他因素、影响培养基灭菌的其他因素 影响培养基灭菌除了所污染杂菌的种影响培养基灭菌除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌时间和温度外，培养基成类、数量、灭菌时间和温度外，培养基成分、分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。基灭菌也有影响。（1）培养基成分）培养基成分 油脂，糖类及一

13、定浓度的蛋白质可增油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。度的盐类，色素等可削弱其耐热性。（2）pH值值 培养基培养基pH为为6.08.0时，微生物耐热时，微生物耐热性好，性好，pH6.0时氢离子容易渗入微生物细时氢离子容易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡，所以培养基的亡，所以培养基的pH值越低，灭菌所需时值越低，灭菌所需时间越短。间越短。（3）培养基的物理状态）培养基的物理状态 颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。当颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。当培

14、养基中有直径大于培养基中有直径大于1mm的颗粒物则明显的颗粒物则明显影响灭菌效果，蒸汽很难渗透到颗粒内部，影响灭菌效果，蒸汽很难渗透到颗粒内部，称为称为“灭菌不透灭菌不透”，应过滤除去。，应过滤除去。（4）泡沫）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。难，热难穿透过去杀灭微生物。 （5）微生物细胞的含水量）微生物细胞的含水量 含水越多，微生物越易死亡含水越多，微生物越易死亡（6）微生物细胞的菌龄）微生物细胞的菌龄 菌龄越老则越不易死亡菌龄越老则越不易死亡（7）空气排除情况）空气排除情况 空气排出越彻底，微生物越易死亡空气排出越彻底，微生

15、物越易死亡5、灭菌时间的计算、灭菌时间的计算（1）分批灭菌时间的计算）分批灭菌时间的计算【例【例3-1】 有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m3培养基，在培养基，在121进行实罐灭菌。原污染程度为每进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有有2105个耐热细菌芽孢，个耐热细菌芽孢，121时灭菌速时灭菌速率常数为率常数为1.8min1。求灭菌失败机率为。求灭菌失败机率为0.001时所需的灭菌时间。时所需的灭菌时间。 有一发酵罐，内装有一发酵罐，内装80 m3培养基，在培养基，在121温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢数为基中含有耐热菌的芽孢数为1.251

16、07个，个，大肠杆菌为大肠杆菌为5107个，霉菌为个，霉菌为2.5107 个个121时灭菌速率常数为时灭菌速率常数为0.0287s1。试求。试求灭菌失败几率为灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。时所需的灭菌时间。 （2）连续灭菌时间的计算）连续灭菌时间的计算【例【例3-2】 若将例若将例3-1中的培养基采用连续中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为灭菌，灭菌温度为131，此温度下灭菌速，此温度下灭菌速率常数为率常数为15min1，求灭菌所需的维持时，求灭菌所需的维持时间。间。 一、空气净化的方法一、空气净化的方法 1 加热灭菌加热灭菌 2 静电除尘静电除尘 3 介质过滤除菌介质过滤除菌二、二

17、、 空气过滤除菌的原理和介质空气过滤除菌的原理和介质 按照过滤除菌机理不同，过滤除菌分为：按照过滤除菌机理不同，过滤除菌分为：绝对过滤：绝对过滤：尘埃或尘埃或M直径过滤介质孔径直径过滤介质孔径相对过滤：相对过滤：尘埃或尘埃或M直径过滤介质孔径直径过滤介质孔径 这种相对过滤又称为深层介质过滤。这种相对过滤又称为深层介质过滤。1、空气过滤除菌的、空气过滤除菌的原理原理（1） 布朗扩散作用布朗扩散作用 （2） 拦截作用拦截作用（3） 惯性碰撞惯性碰撞 （4） 重力沉降重力沉降（5） 静电吸引静电吸引 当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用，当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用， 除菌效率随气流速度增加

18、而上升除菌效率随气流速度增加而上升 当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用，当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用， 除菌效率随气流速度增加而降低除菌效率随气流速度增加而降低 当气流速度中等时，拦截起主要作用当气流速度中等时，拦截起主要作用 当气流速度过大时，已被捕集的微粒又被湍当气流速度过大时，已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回气流中，除菌效率下降动的气流夹带返回气流中，除菌效率下降 2、空气过滤除菌的介质、空气过滤除菌的介质 （1 1） 纤维状或颗粒状介质纤维状或颗粒状介质 棉花棉花 玻璃纤维玻璃纤维 活性炭活性炭 这类过滤介质对这类过滤介质对0.3m以下的颗粒过滤效率以下的颗粒过滤效率仅为

19、仅为99%，难以满足工业发酵的无菌要求，需多，难以满足工业发酵的无菌要求，需多次过滤。次过滤。 缺点：体积大，占用空间大，操作困难，装缺点：体积大，占用空间大，操作困难，装填介质费时费力且松紧度不易掌握，空气压力降填介质费时费力且松紧度不易掌握，空气压力降大，介质灭菌和吹干耗用大量的蒸汽和空气。大，介质灭菌和吹干耗用大量的蒸汽和空气。深层棉花、活性炭过滤器的结构 （2）过滤纸类介质）过滤纸类介质 超细玻璃纤维纸：这类介质过滤效果较好，超细玻璃纤维纸：这类介质过滤效果较好，对空气的阻力和压力降较小。缺点是强度不够，对空气的阻力和压力降较小。缺点是强度不够，特别是受潮后强度更差。特别是受潮后强度更

20、差。石棉滤板：优点是湿强度大，受潮时不易穿石棉滤板：优点是湿强度大，受潮时不易穿孔或折断，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间长。孔或折断，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间长。缺点是由于纤维直径大，过滤效率不高，只适缺点是由于纤维直径大，过滤效率不高，只适用于空气分过滤器。用于空气分过滤器。滤棒：滤棒： 3. 烧结材料类介质烧结材料类介质 烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等4. 新型过滤介质新型过滤介质 能除去全部能除去全部M，但不能除去噬菌体的过，但不能除去噬菌体的过滤介质，主要有膜孔小于滤介质，主要有膜孔小于0.22um的聚偏四氟的聚偏四氟乙烯（乙烯（PVDF）和聚四氟乙烯（）和聚四氟乙烯（PTFE）膜材）膜材 能除去小至能除去小至0.01um的微粒，可除去噬的微粒，可除去噬菌体，主要有菌体，主要有Bio-X滤材和膨化聚四氟乙烯滤材和膨化聚四氟乙烯三、三、 空气过滤除菌的流程空气过滤除菌的流程1、空气的预处理：、空气的预处理：（1） 空气的粗滤空气的粗滤（2） 空气的压缩和稳压空气的