酶生物传感器

1、电化学电化学酶酶生物传感器生物传感器分析化学李蕊目录一、电化学一、电化学酶生物传感器的酶生物传感器的概念概念二、电化学二、电化学酶生物传感器发展酶生物传感器发展历程历程 （1 1）第一代酶生物传感器 （2 2）第二代酶生物传感器 （3 3）第三代酶生物传感器三、三、纳米材料在生物传感器方面的纳米材料在生物传感器方面的应用应用 （1 1）金属纳米材料在生物传感器中的应用 （2 2）半导体纳米材料在生物传感器中的应用 （3 3）碳纳米材料在生物传感器中的应用 （4 4）磁性纳米材料在生物传感器中的应用电化学酶生物传感器的概念电化学酶生物传感器的概念 电化学酶生物传感器(Electrochemica

2、l enzyme biosensor)主要是由固定化酶(分子识别元件)与离子选择电极气敏电极、氧化还原电极等基础电极(信号转换器)有机结合而成的,如果固定在分子识别材料膜上的酶发生化学反应,该化学反应会引起电子在酶和电极之间进行迁移,产生的电子迁移量可以通过基体电极加以检测。电化学酶生物传感器根据测量电化学性质的不同,可以分为电压测量(电位型传感器）和电流测量(电流型传感器)两种类型。电位型传感器和电流型传感器电位型传感器和电流型传感器 待测目标物质和酶产生化学反应时,参与化学反应的被测物质和电极之间的输出电压信号服从Nerst关系,这种通过电压测量被测物质的的传感器为电位传感器。同时酶促反应

3、所引起的待测目标物质的变化也可以通过一定方式转变为电流信号,此时电流信号和待测目标物质的浓度之间服从一定的关系，这种通过电流测量被测物质的的传感器为电流传感器。电化学酶生物传感器发展历程电化学酶生物传感器发展历程电化学酶生物传感器又称酶电极,是最早研发的一种电化学生物传感器。第一代酶生物传感器 第一代酶生物传感器的构建原理主要依据酶催化的化学反应过程中产生或消耗的电活性物质,而活性物质的变化能够转变为电信号。如果酶催化的化学反应过程中有酸生成,则基础器件可采用pH电极;如果酶促反应过程中要消耗氧，则可选用氧电极或过氧化氢电极作为基础器件。 以基于氧为电子传递体的葡萄糖传感器为例,其氧化机理为:

4、在氧气存在条件下,葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖生成葡萄酸内酯和过氧化氧。C6H12O6 + H2O + O2葡萄糖氧化酶 C6H12O7 + H2O2 可以把过氧化氢电极或氧电极作为基础电极,检测化学反应产物双氧水浓度的变化或氧分子的消耗量,然后依据上面化学反应方程式计算葡萄糖的浓度。第二代酶生物传感器 第二代酶生物传感器是以电子媒介体修饰为基础的电催化,该电子媒介体的主要作用是能够代替电子受体氧分子在酶反应和电极之间进行电子传递,这些媒介体能够在酶的氧化还原中心和修饰电极的表面建立一个传输通道,使得电子能够在通道中快速迁移并形成响应电流。引入这种电子传递媒介体可以建立一个电子迁移的通道,不但可

5、以提高电子传输速度、排除其它物质干扰,而且可以降低工作电压。所以第二代酶生物传感器能够有效提高传感器检测目标物质的准确性并降低检测限。电子传递媒介体电子传递媒介体 电子传递媒介体是关键的一个环节,决定修饰电极的测量精度和范围。一个性能优良的电子传递媒介体应具有以下的品质：(a)与氧不发生反应 (b)氧化态和还原态能稳定存在(c)具有较低的氧化还原电位,并不受pH的影响 (d)呈现可逆的电子转移动力学 (e)能快速的与酶进行电子交换,提高响应电流密度(f)易于固定在电极表面。 符合上述性质的常用电子媒介体主要包括有机染料、四硫富瓦稀、二茂铁及其衍生物、醌及其衍生物等。示例示例1 1 Li W.

6、J. _等引入一种新的有机物-芘四甲酸的胺解产物(PTC-NH2),将普鲁士蓝(PB)固定在GCE的外表面,然后在其上包裹一层PTC-NH2防止其渗透而污染测试液,接着采用化学手段把gold/platinum hybrid nanostructure supported on silica nanofibers （GP-SNFs）绑定到PTC-NH2和普鲁士蓝组合物外表,用来捕获半刀豆球蛋白,为了提髙传感器灵敏度将葡萄糖氧化酶(GOD)通过凝集素-糖蛋白绑定到电极上，制得葡萄糖生物传感器。示例示例2 2 Chen S. H等以戊二醛为交联剂,将硫堇(Th)共价键合到牛血清白蛋白(BSA)膜上,

7、进而把纳米金(nano-Au)及辣根过氧化物酶(HRP)牢牢绑定在面上,研制出了灵敏度高、适应能力强的双氧水传感器。第三代酶生物传感器 直接电化学酶电极即第三代酶生物传感器,与第一代和第二代酶生物传感器相比,直接电化学酶电极摆脱了对中间体(氧气或人工电子媒介体)的依赖,酶和电极之间牢牢绑定无需任何中间体,此时酶的氧化还原中心就可以和电极无隔阂的紧密联系在一起,这种方式的结合可以加快电子迁移的速度,加强电信号,提高酶传感器灵敏性、精度。示例示例1 Zhong H.A 等首先以过硫酸钾为氧化剂原位合成了多壁碳纳米管-聚苯胺(MWCNT-PANI)纳米复合材料并滴涂于裸GCE外表,所获得的纳米复合材

8、料具有多孔结构,且继承了不同物质的特性具有优秀的导电性和氧化还原活性。其次在不变电压情况下采用沉积法将铂纳米粒子固定到电极外表。最后采用胶醛的键合力和铂纳米粒子的吸附力把葡萄糖氧化酶(GOD)牢牢固定到电极外表面,制得葡萄糖生物传感器。Emeraldine-苯胺绿KPS-过硫酸钾leucoemeraldine -还原态聚苯胺Gluconolactone- -葡萄糖酸内酯示例示例2 Chen S. 等以血红蛋白为联接剂,通过静电吸附作用成功制得了碳纳米管和纳米金的复合材料,并基于此纳米复合材料制备了第三代过氧化氢生物传感器。在多壁碳纳米管及纳米金的双重影响下,MWNTs/nano-Au组合的新材

9、料可以帮助血红蛋白快速和电极之间进行快速电子迁移,加强电信号的强度。与仅基于CNTs构建的过氧化氢传感器相比,这种第三代过氧化氢生物传感器可以检测更低浓度的物质含量,并且精度更高。纳米材料在生物传感器方面的应用纳米材料在生物传感器方面的应用 纳米技术在电化学生物传感器的研究方面主要发挥以下作用:(1)催化反应(2)提高电子迁移速度,加强在电极表面氧化还原物质化学反应的可逆性(3)固定生物分子(4)反应控制开关(5)标记生物分子等。纳米材料的引入对酶的影响纳米材料的引入对酶的影响 在纳米材料的影响下酶蛋白的分子构型会产生根本性的改变。没有添加纳米材料时氧化还原中心被糖蛋白紧紧的包围在酶蛋白中心,

10、氧化还原中心很难和电极表面之间进行电子交换。当纳米材料参与时会同酶蛋白中的疏基或氨基产生键合,这时酶的分子形状会产生翻天覆地的变化,此时糖蛋白将氧化还原活性中心释放出来,而与纳米材料结合在一起,纳米材料和酶蛋白作用构型变化见图。金属纳米材料在生物传感器中的应用 金纳米粒子在生物传感器中主要用做探针载体和信号分子,这是由于:(1)金纳米粒子的直径在1100 nm之间,这和绝大部分生物分子尺寸接近,利用金纳米材料生物相容性等性质和生物分子结合在一起,释放氧化还原中心,并且在生物分子内部形成输电通道,减少生物活性中心和电极之间的距离,提高电子迁移速度 (2)金纳米粒子能与生物分子内的氢硫基、氰基等基

11、团产生共价键合,形成分子探针(3)金纳米粒子有相对较大的比表面积和较髙的化学活性等优点,在固载和标记生物蛋白质常常选金纳米粒子作为载体(4)可以方便通过调节由四氯合金酸和柠檬酸钠反应物质比例来调控金纳米粒子的尺寸。示例示例1 1 Itamar Willner等研制了一种灵敏度、精度高、稳定性好的葡萄糖生物传感器。这种高精度的传感器的研制成功主要是因为采用了金纳米粒子及聚苯胺(PAn)共修饰了电极。示例示例2 2 Su H.L.等在修饰有硫堇、碳纳米管的玻碳电极表面吸附纳米金,通过纳米金吸附固定甲胎蛋白抗体,制备甲胎蛋白免疫传感器。(a) fabrication of Nafion-MWCNT

12、monolayer (b) absorption of Thi (c) formation of nano-Au (d) absorption of anti-AFP (e) BSA blocking.半导体纳米材料在生物传感器中的应用 在生物传感器的制备过程中,半导体纳米材料因具有生物相容性好、比表面积大、吸附力强、毒性低等优点,被广泛的用作蛋白质和酶的固定载体。其中,以SiO2和TiO2为代表的半导体纳米材料的应用最为广泛。 SiO2本身具有极高化学活性,在物理上由于其比表面积大具有极强的吸附能力。吸附后其表面包含不饱和的残键以及不同键合状态的经基,这种结构易于与其他供电子功能基团发生键合

13、作用。 TiO2是一种有效的半导体纳米材料,其表面富含羟基,具有比表面积大、化学性质稳定、对大多数生物分子无害等优点,在电化学生物传感器的制备中被广泛的用于在电极表面固定酶和蛋白质。示例示例1 1 Hong C.L.等利用微乳化方法在纳米二氧化硅外面包裹了一层环戊二稀基铁,修饰到电极表面后成功制备了一种新型的无试剂电流型免疫传感器 。外面包裹了环戊二稀基铁的纳米二氧化硅颗粒固定到电极表面后,有效的在电极表面固载了氧化还原探针环戊二稀基铁,修饰电极具有良好的可逆的氧化还原活性。这种经过处理的二氧化硅微小颗粒均匀稳定的覆盖在电极表面,具有大的比表面积和较高表面反应活性的优秀特性可以使二氧化硅纳米材

14、料将CA 15-3抗体蛋白牢牢固定在表面。(a) formation of amino functionalized Fc-COOH-doped SNPs layer(b)glutaraldehyde cross-linkage(c) anti-CA 15-3 loading(d) BSA loading.示例示例2 2 Yang X.等用油水微乳相法合成Si02Ru纳米颗粒,这种典型的油包水结构内层包埋了大量的水溶性Ru(bpy)32+分子,外表面则含有丰富的带负电荷的羟基,可与蛋白分子上的羧基酯化交联用于标记二抗,构建ECL （电化学发光）免疫传感器。与单分子标记相比,Si02Ru纳米颗粒

15、可标记大量Ru(bpy)32+于二抗分子上,极大的放大了 ECL响应信号。示例示例3 3 Mao L.等合成Nafion（全氟磺酸）包裹的TiO2纳米颗粒用来嵌合二抗并俘获Ru(bpy)32+将Ru-NafionTi02复合纳米颗粒标记的二抗用于夹心式免疫传感器的制备 。实验中利用复合纳米颗粒连接的多重二抗分子可俘获大量ECL信号探针,有效避免因多位点标记而造成的蛋白质灭活,使传感器达到较高的灵敏度。HCG:人绒毛膜促性腺激素示例示例4 4 ZhuoY.等制备了基于Ti02和纳米金的复合纳米球,并用其固定二茂铁标记的ProGRP（胃泌素释放肽） 二抗和葡糖糖氧化酶,以构建无试剂电流型免疫传感器

16、。基于二氧化钛和纳米金大的比表面积和强的吸附能力,复合纳米球表面固定了大量的ProGRP 二抗和葡糖糖氧化酶,制得的免疫传感器的灵敏度得到明显提高。Fc labeled anti-ProGRP:二茂铁标记辅助ProGRP抗体碳纳米材料在生物传感器中的应用 碳纳米材料是指分散相尺度至少有一维小于lOOnm的碳材料。目前研究较多的碳纳米材料是碳纳米管、石墨稀、碳纳米纤维等,它们具有环境友好、比表面积大以及多项优良的物理和化学性质,因而在生物传感领域得到了广泛的应用。碳纳米管在生物传感器中的应用碳纳米管(Carbon nanotubes, CNTs)是类石墨片卷曲而成的纳米级中空管,其微观结构是以碳

17、原子sp2杂化为主,混sp3杂化构成的碳六元环,被认为是富勒稀分子。 Chen S. H.等将多壁碳纳米管(MWNTs)分散于带正电的有机硅/壳聚糖纳米球(organosilicachitosan)的悬浮液中, 制备的organosilicachitosan/MWNTs复合材料用于固定辣根过氧化物酶(HRP),构建了无电子媒介体的过氧化氯生物传感器。有机硅/壳聚糖纳米球和多壁碳纳米管为辣根过氧化物酶(HRP)提供了好的生物微环境,有效增大了电极的比表面积,增加了HRP的固载量,制得的传感器对过氧化氧有良好的催化活性。示例示例石墨稀在生物传感器中的应用 石墨稀(Graphene)是一种由sp2杂

18、化碳组成的新二维纳米材料,是所有其它维度石墨化材料的基本构造单元。它具有独特的纳米结构和热、电学机械属性。石墨稀有良好的导电性能,用于电化学生物传感器的构建可以缩短传感器的响应时间;石墨稀还具有大的比表面积和良好的生物相容性,可以有效固载酶等生物蛋白分子,并很好的保持其生物活性。示例示例 Su H.L.等基于石墨稀纳米复合材料,提出一种夹心式电化学免疫传感器快速检测猪链球菌2型抗原的方法。其首先制备了一种纳米羧基二茂铁功能化的石墨稀复合材料作为标记物来标记检测抗体,然后通过抗坏血酸在底液中被球形羧基二茂铁催化氧化来进一步增强电化学响应信号,提高检测的灵敏度。磁性纳米材料在生物传感器中的应用 磁性纳米粒子是指具有磁响应特性的纳米级微粒,其一般都含有磁性金属或磁性金属氧化物。磁性纳米粒子既具有一般纳米粒子的比表面积大、生物相容性好的优点,又具有磁性纳米粒子所特有的磁学性质：超顺磁性。磁性纳米粒子可在外加磁场的作用下向磁场方向运动,应用于色谱分析的样品前处理(分离、富集)中,可大大缩短前处理时间;应用于生物传感器的制备中,可提高固载