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文档简介
1、 实验时间实验内容4月11日实验一 培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二 细胞的传代培养4月25日实验三 鱼类细胞原代培养(组织块法)(1-5组)401实验四 染色体制备(6-10组)3015月2日实验三 鱼类细胞原代培养(组织块法)(6-10组)401实验四 染色体制备(1-5组)3015月9日实验五 细胞的复苏与冻存实验一 培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。2. 掌握常用的灭菌方法。3. 了解每种培养用液的作用。【实验原理】 常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)、液体培养基、胰蛋白酶(
2、Trypsin)和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素,使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15;用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来,通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面,螯合Ca2+等二价离子,使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的,PBS和EDTA可以采用高压灭菌,而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质,配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂:NaCl,KCl,Na2HPO4,KH2PO
3、4,EDTA,胰蛋白酶,HEPES,碳酸氢钠,盐酸,MEM或PRMI-1640培养基干粉,GPS材料:三蒸水,蒸馏水瓶,药匙,称量纸,烧杯(250 mL、1000 mL),玻棒,精密pH试纸(6.8-8.0),容量瓶(250 mL、1000 mL),移液管(5 mL、10 mL),一次性注射器,一次性过滤器,普镊,酒精灯,打火机,医用酒精,酒精喷壶,消毒纱布,已高压灭菌试剂瓶(500 mL、250 mL、100 mL),记号笔,标签纸,橡胶手套,封口膜仪器:精密天平,高压灭菌锅,超净工作台,加液枪,4冰箱【实验分组】实验分组进行,每组4人,每班20人,共分5组。配制PBS并高压灭菌,配制胰蛋白
4、酶溶液并过滤除菌和分装,配制EDTA溶液高压灭菌并分装,配制培养基,过滤除菌培养基并分装。每个实验小组需准备试剂有:胰酶 50 mL;EDTA 50 mL;培养基90 mL(使用前加入10 mL血清)。 【实验步骤】 1PBS(1000mL)的配制分别称取NaCl 8g;KCl 0.2g;Na2HPO4·12H2O 2.9g ;KH2PO4 0.2g于烧杯,加入800 mL三蒸水,玻棒搅动充分溶解后,倒入1000mL容量瓶中,用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制,余下高压灭菌备用。2胰蛋白酶溶液(0.25%)的配制、除菌与分装 称取0.625g胰蛋白酶
5、于250 mL烧杯,加入1配制的PBS 200 mL,玻棒搅拌充分溶解后,倒入250 mL容量瓶中,用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌,并分装至5个试剂瓶(100 mL),每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖,贴好标签,封口膜封口,放4 冰箱保存备用。标签上标明:0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。 3EDTA(0.2)的配制、除菌与分装 称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯,加入1配制的PBS 200 mL,溶解时加少量NaHCO3,调整pH为8.0,玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里,终浓度为0.2%,用浓盐酸,调p
6、H为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中,高压灭菌备用。在超净工作台内,将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶(100 mL),每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖,贴好标签,封口膜封口,放4 冰箱保存备用。标签上标明:0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。4培养基的配制、除菌与分装 将培养基干粉(MEM或PRMI-1640)倒入1000 mL烧杯,加800mL三蒸水,玻棒搅拌充分溶解;再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠,玻棒搅拌充分溶解,溶液呈橙色(弱酸性,pH在7.0左右);再倒入1000 mL容量瓶,用三蒸水定容至刻度。工作前打开超净工作台上的紫
7、外灯,灭菌30分钟后,关闭紫外灯,打开吹风和照明灯;带橡胶手套,用酒精擦拭消毒双手;超净工作台面用酒精喷洒,再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。将培养液拿入超净工作台过滤除菌,并分装至5个无菌试剂瓶(100 mL),每瓶90 mL,余下装入500 mL无菌试剂瓶,每瓶内需加入无菌的GPS(谷氨酰胺-青霉素-链霉素),轻轻摇匀,使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖,贴好标签,封口膜封口,放4 冰箱保存备用。标签上标明:MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。 用于细胞培养时,培养基内需要加入血清,生长培养基内血清浓度为10%。 【注意事项】1. 滤过
8、除菌时,将容量瓶内的液体倒入烧杯内,再拿到超净台里,采用一次性滤器或是抽滤法除菌。 2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末,也可在过滤除菌后加入无菌的液体,终浓度为100 U/mL 青霉素和100 g/mL链霉素。 【思考题】1. 配制细胞生长培养液时,需要添加哪些物质,为什么?如何调节培养液的pH?2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加,为什么? 3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些,如何使用? 实验二 细胞的传代培养【实验目的】 1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。2. 了解细胞传代培养的意义。【实验原理】细胞在培养瓶里的生长,分为贴壁生长和悬浮生长。
9、贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后,就会在培养瓶底部长满,如果不进行处理,就会继续生长而产生堆积,最后因缺乏营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时,就需要将细胞消化下来,并接种成多瓶细胞,使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代,每接种一次就叫做传一代。细胞传代培养使得细胞增殖,可获得大量细胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之一,是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养,培养的温度视动物种类而定。一般,温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28,冷水鱼类细胞为15-20,水生哺乳动物细胞为37。细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞
10、生长因素,而此时细胞还未生长达到饱和密度(没有贴满底部),仍需继续培养,因而需要更新营养液来更新营养成分,以满足细胞继续生长繁殖的需要,这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。 【试剂、材料与仪器】试剂:生长培养基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA材料:细胞培养瓶,移液管(5 mL、10 mL),无菌离心管,废液缸,普镊,酒精灯,打火机,医用酒精,酒精喷壶,消毒纱布,记号笔,橡胶手套,封口膜仪器:生化培养箱或CO2培养箱,倒置生物显微镜,超净工作台,加液枪,低速离心机,4冰箱【实验分组】 实验分组进行,每组4人,每班20人
11、,共分5组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯,灭菌30分钟后,关闭紫外灯,打开吹风和照明灯;带橡胶手套,用酒精擦拭消毒双手;超净工作台面用酒精喷洒,再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。1 观察细胞:倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代,当细胞长满瓶底时可以传代;2 超净工作台准备:将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒,用消毒纱布擦净,置于超净工作台酒精灯左侧;3 开盖:旋开细胞培养瓶瓶盖,将瓶盖侧立于(严禁倒扣放置)酒精灯旁,将培养瓶内液体(旧培养基)倒入15 mL离心管,3000 rpm/min 离心5 min 备用。培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管
12、管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好;4 清洗细胞表面:打开移液管盒,用普镊捏住移液管(5mL)后部从盒子中拖出(注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品),安装好加液枪,移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液,清洗细胞表面,去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞,再倒弃EDTA溶液;5 胰酶消化:用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶,从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内,盖好瓶盖后,在倒置显微镜下观察,当80%的细胞收回突起变圆时,立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶;6 中和消化:用移液管吸取旧培养基上清液3 mL(也可用新鲜生长培养基),加入细胞培养瓶中,终止胰酶消化,并反复轻轻吹打消
13、化好的细胞使其脱离瓶壁并分散;7 沉淀细胞:将细胞悬液吸入15 mL的离心管中,1000 rpm/min离心8分钟,获得细胞沉淀;8 加入新鲜培养基:倒弃上清液,保留细胞沉淀(注意只能倒一次,不能反复倒),然后用另一新移液管吸取10 mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL,余下5mL加入离心管内悬浮细胞沉淀,吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中,与另外5mL培养基混匀;9 接种细胞:吸取5 mL上述的细胞悬液,加入另一个新细胞培养瓶中,接种后2个培养瓶中的悬液各5 mL;10. 静置培养:盖上瓶盖,拧紧,标记(包括细胞名称、代数、传代日期),放入常规的生化培养箱静置培养(如果放入CO2培养箱,瓶
14、盖拧紧后再稍回转);11. 观察细胞:每天观察细胞生长状况,并确定是否进行第2代的传代。【注意事项】1. 传代培养时要注意无菌操作,所有操作要尽量靠近酒精灯火焰,手不能在瓶口上方操作,以免污染气体进入瓶内。要防止细胞之间的交叉污染,每次最好只进行一种细胞的操作,每一种细胞使用一套器材。每种试剂使用一个移液管,培养用液要严格分开。2. 坚持每天观察细胞,生长致密时即可传代。如发现有污染迹象,应丢弃污染的细胞。3. 细胞消化时要注意观察,不要消化过度,否则细胞不宜存活。吹打细胞时,确保瓶壁所有地方均吹打到,吹打时动作要轻柔,不要用力过大,以防细胞破碎。4. 培养箱不要反复多次开关,以免影响温度的稳
15、定和增加污染的机率。 【思考题】1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。2. 常用的细胞消化液有哪些? 各种消化液的作用原理分别是什么?3. 悬浮生长的细胞如何传代培养?实验三 鱼类细胞原代培养(组织块法)【实验目的】1. 掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。2. 了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。【实验原理】细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械分离法等。组织块法是直接从生物体获取组织,切割成微小的组织块,然后贴附于培养瓶底部,通过培养液供给营养,在合适的温度中孵育,让组织块周边慢慢地长出细胞来,经消化传代,获得大量均一的细胞,用于传代培养和相关细胞实验
16、。 【试剂、材料与仪器】试剂:MEM培养基,GPS,两性霉素B,硫酸庆大霉素,表皮生长因子(EGF),成纤维生长因子(FGF)材料:试验幼鱼,原代培养瓶,无菌培养皿,移液管(5 mL),无菌离心管(15 ml),解剖探针,手术剪,眼科剪,眼科镊,手术刀,医用酒精,烧杯(250 mL),废液缸,普镊,酒精灯,打火机,消毒纱布,酒精喷壶,记号笔,橡胶手套,封口膜仪器:生化培养箱或CO2培养箱,倒置生物显微镜,超净工作台,加液枪,4冰箱【实验分组】实验分组进行,每组4人,每班20人,共分5组,每组中分别取肌肉、鳍条、肝和鳔4种组织。 【实验步骤】1. 试剂配制抗生素培养基(AIM): 90 mL培养
17、液(2×MEM)+ 5 mL GPS(10×)+5 mL两性霉素B(250 g/mL)+1 mL硫酸庆大霉素(50 mg/mL)混合,4保存备用。原代培养基:80 mL培养液 + 2 mL GPS (10×) + 20 mL FBS + EGF(2 g/mL)+ FGF(25 ng/mL)混合,4保存备用。传代培养基:90 mL培养液 + 1 mL GPS (10×) + 10 mL FBS混合,4保存备用。2. 组织分离和细胞培养工作前打开超净工作台上的紫外灯,灭菌30分钟后,关闭紫外灯,打开吹风和照明灯;带橡胶手套,用酒精擦拭消毒双手;超净工作台面用
18、酒精喷洒,再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好培养皿、移液管和培养瓶。将灭过菌的手术器械(解剖刀2把,眼科镊2把,眼科剪1把)插入盛有医用酒精的玻璃烧杯中浸泡备用。以下操作均在超净台里进行: 1) 杀幼鱼与消毒体表:用解剖探针破坏幼鱼脑后,将幼鱼置于酒精中,浸泡30秒。 2) 取肌肉与鳍条:用消毒纱布托住鱼体,用手术剪取下鳍条或背部肌肉,并置于盛有AIM培养基的培养皿(1)内浸泡消毒,培养皿上写上组织名称。3) 用纱布擦去手术器械上的残余组织,将手术器械放入盛有医用酒精的烧杯中涮洗浸泡。用眼科剪打开体腔,用眼科镊取出肝或鳔,并置于盛有AIM的培养皿(2)内浸泡消毒,培养皿上写上组织名称。注意
19、:取体表和体内不同的组织时,手术器械应分开并浸泡消毒,防止组织细胞交叉污染。4) 组织块在AIM内浸泡2小时,每半小时换1次AIM培养基。换液方法:涮洗AIM中的组织块,倒去旧液,用移液管吸取新鲜AIM加入培养皿内。5) 用眼科镊夹取组织块,移入无菌培养皿(3)内,用手术刀切除和刮去多余的组织,如脂肪和坏死组织,血液、筋膜等,再用新移液管吸AIM清洗组织块1-2次。6) 将组织块移入无菌培养皿(4)内,用手术刀将组织块切成约1mm2的小块,用新移液管吸取AIM少量,将组织碎块浸润。7) 打开培养瓶盖,用新移液管吸取湿润的微小组织块(约20-30个),接种于25 cm2培养瓶底部,用移液管将组织
20、块涂抹均匀,培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧,培养瓶上做好标记(包括组织名称和原代培养日期)。8) 将培养瓶拿到培养箱内,静置贴壁2小时,再将培养瓶侧放半小时,用移液管将残余液体吸出。9) 用新移液管从细胞培养瓶侧面缓慢加入 4-5 mL原代培养基,培养瓶保持竖立,培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧。小心将细胞培养瓶拿入培养箱内,缓慢轻柔地将培养瓶平放(让培养基慢慢浸润组织块,避免组织块脱离瓶壁漂浮),静置培养。10) 注意观察细胞生长情况,大约1-2周后,细胞开始从组织块底部延伸出来。当细胞长满时,可消化传代,原瓶可保留继续生长细胞。【注意事项】1 尽量选取幼年的生物体组织或者
21、繁殖能力较强的组织,如幼鱼、胚胎、肿瘤组织等,作为实验材料。2 原代培养时要注意无菌操作,所有操作要尽量靠近酒精灯火焰,手不能在瓶口上方操作,以免污染气体进入瓶内。要防止组织之间的交叉污染,注意更换移液管。3 组织块要静置贴壁2小时,能黏附于瓶壁时,再与加入培养液,操作要轻且缓慢,勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁,细胞则不易生长。如组织块漂浮,需重新贴壁!【思考题】1. 细胞原代培养(组织块法)的方法及注意事项。2. 常用的细胞原代培养方法有哪些?分别适用于哪些组织?实验四 细胞的冻存【实验目的】1. 掌握细胞保存的方法2. 熟悉细胞冻存的原理【实验原理】细胞冻存是细胞保存的主要方法之一
22、。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞特性,在需要的时候再复苏细胞用于实验。冻存细胞还起到了细胞保种的作用,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种。细胞冻存时向培养基中加入保护剂二甲基亚砜(DMSO,终浓度5 - 15%),可使溶液冰点降低,在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞的存活。标准冷冻速度开始为 -1- -2/min,当温度低于- 25时可加速,到- 80之后可直接投入液氮内(-196)。【试剂、材料与仪器】试剂:生长培养基(PRMI-1640或 MEM
23、,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA,二甲基亚砜(DMSO),液氮,异丙醇材料:冻存管,移液管(2 mL、5 mL),无菌离心管,废液缸,普镊,酒精灯,打火机,消毒纱布,医用酒精,酒精喷壶,记号笔,橡胶手套,封口膜仪器:倒置生物显微镜,超净工作台,加液枪,低速离心机,4冰箱,-80冰箱,程序降温盒,液氮罐,制冰机【实验分组】实验分组进行,每组4人,每班20人,共分5组。 【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯,灭菌30分钟后,关闭紫外灯,打开吹风和照明灯;带橡胶手套,用酒精擦拭消毒双手;超净工作台面用酒精喷洒,再用消毒纱布擦净。程序降温盒盛装异丙醇,
24、使用前4预冷。在超净工作台中摆放好冻存管、移液管、离心管和试剂瓶。冻存管上作好标记,包括细胞名称,代数和冻存日期。1. 收集细胞:取待冻存的细胞,倒弃旧液,用移液管吸取2-4 mL EDTA清洗细胞表面, 弃去,再吸取2 mL胰蛋白酶加入细胞培养瓶,消化1-2分钟,轻轻拍打瓶侧,使细胞脱离瓶底。加入2 mL培养基将细胞轻轻吹打冲洗下来,移入15 mL离心管,1000 rpm/min离心7 min,弃上清,保留离心管底部细胞沉淀。2. 细胞冻存液的配制:在15 mL离心管中依次加入:DMSO 0.6 mL、新鲜培养液 1.8 mL和血清0.6 mL,作为A液(3 mL)。轻轻吹打混匀,离心管加盖
25、后立即插入冰里。注意吸取试剂时,移液管均需更换,不能混用。3. 冻存细胞:在1步获得的细胞沉淀中,加入3 mL培养液,轻轻吹打混匀,制成细胞悬浮(B液)。吸取细胞悬液(B液)与A液均匀混合。混合时,从离心管底部向上缓慢拖着滴加,边加边转动移液管,使细胞与冻存液充分混匀。混合后细胞悬液为6 mL,分装于冻存管中,每管1-1.5 mL,盖好冻存管盖,放入盛有异丙醇的程序降温盒中,立即放入-80,24小时后,将装有细胞的冻存管转移到液氮内,并做好记录。 【注意事项】1 冻存液需现配现用,配制好后放置在冰中,保持低温。冻存液中含20%血清和10% DMSO,配制时添加血清和DMSO要错开,即血清和DM
26、SO二者不能直接混合。2 程序降温盒要提前装好异丙醇,且4预冷。3 冻存管内细胞的密度通常为105-106个/ mL,一般铺满一个25 cm2的细胞培养瓶的细胞量可以冻存1-2mL。4 准备进行冻存的细胞,要处于对数生长期,即细胞传代后24h 左右,且细胞生长状态良好,这样才能保证冻存细胞复苏时,有较高的存活率。5 要准确记录冻存细胞的种类,代数,冻存时间和冻存者的姓名。【思考题】1 为什么要配制细胞冻存(A液),并将细胞悬液(B液)与之混合? 2 冻存细胞时,为什么要加入二甲基亚砜?为什么要缓慢降温?实验五 细胞的复苏【实验目的】1. 掌握细胞复苏的方法2. 熟悉细胞复苏的原理【实验原理】细
27、胞复苏时要快速融化,必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化,使细胞冻存时产生的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。复苏后的细胞可继续进行传代增殖,做实验材料和再次冻存。【试剂、材料与仪器】试剂:生长培养基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清)材料:细胞培养瓶,移液管(5 mL、10 mL),无菌离心管,废液缸,普镊,酒精灯,打火机,消毒纱布,医用酒精,酒精喷壶,记号笔,橡胶手套,封口膜仪器:生化培养箱或CO2培养箱,倒置生物显微镜,超净工作台,加液枪,低速离心机,水浴锅,液氮罐【实验分组】 实验分组进行,每组4人,每班20人,共分5组
28、。 【实验步骤】 工作前打开超净工作台上的紫外灯,灭菌30分钟后,关闭紫外灯,打开吹风和照明灯;带橡胶手套,用酒精擦拭消毒双手;超净工作台面用酒精喷洒,再用消毒纱布擦净。将水浴锅预热至37,在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶。1. 取出冻存管:根据细胞冻存记录找到所需细胞存放之处,从液氮罐中取出待复苏细胞。 2. 迅速解冻:立即将冻存管放入37温水中迅速解冻,要不断晃动冻存管,大约在1min内使冻存管内液体完全溶解。取出冻存管,酒精喷洒擦拭冻存管盖周边,拿入超净工作台。3. 加培养液:吸取冻存管内的细胞悬液,加入离心管,再向离心管内加入5-8 mL生长培养液,1000 rpm
29、/min 离心8 min,获得细胞沉淀。倒弃上清,加入4-5 mL 生长培养基,轻轻吹打混匀细胞,将细胞移入细胞培养瓶。4. 贴壁与换液:将细胞于培养箱中静置培养24小时,观察细胞贴壁情况。吸去旧液, 加入新鲜生长培养基。【注意事项】1. 细胞复苏时,注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-50)。这样复苏的冻存细胞存活率高,细胞生长及形态良好。2. 由于冻存的细胞中会有部分细胞死亡,静置培养24小时后,可将不贴壁、飘浮在培养液上的死细胞弃去,更换新鲜培养液。3. 如果冻存的细胞保存时间较长或之前细胞复苏时,细胞存活率不高,可以直接在培养瓶内加入冻存管内的细
30、胞悬液和5 mL的新鲜培养基,静置培养10-12h后,更换新鲜培养基。【思考题】1 复苏细胞时,为什么要快速融化? 2 如果冻存管内的细胞密度偏低,复苏时如何处理? 实验六 染色体制备【实验目的】1. 掌握培养细胞的染色体的制备方法2. 熟悉细胞染色体制备的原理【实验原理】每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期,此时染色体形态最典型,然后通过低渗、固定、染色等步骤,便可在显微镜下呈现出其形态。 【试剂、材料与仪器】试剂:生长培养基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA,PBS,冰醋酸,甲醇,秋水仙碱,95%乙醇,HCl ,Giemsa染液,双蒸水材料:细胞培养瓶,移液管(5 mL、10 mL),无菌离心管,载玻片,胶头滴管,染色缸,废液缸,普镊,酒精灯,打火机,消毒纱布,医用酒精,酒精喷壶,记号笔,橡胶手套,封口膜仪器:生化培养箱或CO2培养箱,倒置生物显微镜,超净工作台,加液枪,低速离心机,切片烘干机,制冰机,
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