植物遗传改良讲义稿

1、植物分子育种第一章 植物分子育种技术概论常规育种虽然在农作物产量提高和品质改良方面取得了很大成绩，但它存在着局限性：一是遗传物质的转移难以突破生物学隔离的障碍，使优良种质资源的利用受到限制;二是由于基因连锁的困扰，又不易收到理想的育种效果。近年来迅速发展的生物技术，特别是分子水平的生物技术，在提高作物产量，改善品质，增强抗病虫和抗逆能力等方面展示了诱人的灿烂前景第一节 植物分子育种的概念和特点一、植物分子育种的概念 植物分子育种是近代开创的育种新途径，大量实践证明我国在这方面取得了重要进展。 分子育种是指分子水平生物技术在植物育种上的应用。中国科学院上海生物化学研究所周光宇研究员指出，植物分子

2、育种可概括为两个层次的工程技术：1.将带有目的性状基因的供体总dna片段导入欲改良的植物受体细胞，使其后代发生变异，从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型，培育出高产、优质、抗性强的新品种。2分离目的基因，构建重组分子，导入需要改良的植物受体细胞，经过培育，筛选出获得了目的性状，且综合性状优良的后代，育出新品种。 狭义的分子育种指的是第一层次的分子育种。二、植物分子育种的特点 1.遗传物质的转移突破生物学隔离的障碍打破物种分类的界限，充分利用自然界丰富的遗传资源，使遗传物质能在不同植物间，甚至在植物，动物和微生物之间进行交流，从而充分活化各物种的遗传基础，为创造新的生命类型奠定

3、广泛的基础2.无需经过细胞、原生质体离体培养（甚至不需离体培养）(针对狭义的分子育种来说) 利用整体植株的特定细胞进行外源dna或基因的转移，如卵细胞、受精卵或早期胚细胞，抑或幼胚，幼苗、芽丛分裂旺盛的细胞，它们随着整体生长发育的进程而完成外源dna或基因的导入、整合与转化过程。无需经过细胞、原生质体离体培养，转化诱导，形成再生株植等一系列繁琐复杂的培养流程。3适应面广: 单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。4与常规育种相比，育种时间明显缩短，一般只需34代各选系便可稳定。5方法简便: 室内外(大田、盆栽场、温室等)均可进行，常规育种工作者易于掌握。第二节 植物分子

4、育种的产生与发展一.问题的提出 吉林农民李贞生培育出的玉米稻（水稻×玉米）50年代 杂种玉米稻未见父本的外观性状；从染色体的形态特征、数目和组型分析来看，均与母本水稻相同； 但无可否认地出现了一些明显的变异：如植株高、穗大、粒大，抗逆性(耐寒，耐旱)强、产量提高，而且这些变异还 可以遗传下去。后来发现在以高梁、甘蔗和芦苇作父本，而以水稻作母本的远缘杂交实验中，也获得了类似的结果：即后代的外观特点与母本水稻一致，但也或多或少显露出一部分远缘的遗传信息在遗传育种界对此尚存在学术观点不一的争论：有人持否定态瘦，认为玉米稻不可能是杂交种，把所出现的变异归咎于母本不纯，或纯属自发变异。也有人认

5、为变异是由玉米花粉物质刺激作用；甚至还有人认为玉米稻要长出玉米棒子才算是真正的杂种二.dna片段杂交假说及其分子验证 1974年，周光宇多次对粮食等作物远缘杂交实验进行实地调查。 要点：（1）认为就整体分子而言，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的，容易相互排斥；（2）根据进化的观点，局部dna分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性；因而远缘dna片段有可能进入受体细胞，并在母本dna复制过程中，这种dna片段便与受体基因组相应区段整合。周光宇提出了“dna片段杂交”假说，并应用同工酶和分子杂交等技术对祖德明等培育的高梁稻及其亲本材料进行了分析，使这一假说得到了分子验证。分子验证： 酯酶同工酶

6、分析 在高梁稻(银坊×亨加利)及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高梁相同而银坊(母本)没有的酶带，说明高梁稻中的这条酶带来自父本高梁； 分子杂交 取父本高梁dna与母本水稻dna进行分子杂交，除去两者的同源序列，以其余的高梁dna顺序制备探针，与高梁稻dna进行分子杂交，发现高梁稻dna中存在高梁的同源序列，此即说明高梁dna片段已整合了高粱稻的基因组中； 复性动力学分析 在对高梁稻及其两亲本的重复顺序dna复性动力学分析研究中，发现高粱稻基因组的中度重复顺序部分与母本水稻有差异，从而进一步说明这是由于父本高梁dna整合于母本水稻基因组而造成的结果。第三节 外源dna导入育种技术

7、的探索一、花粉管通道技术（周光宇，1978）花粉管通道技术的关键：在于外源dna(不小于106107u)可以方便地利用植物开花授粉后天然的花粉管通道进入胚囊，与受精卵或其前后的细胞相接触。机理：1、这类细胞在此时尚不具备细胞壁，有如原生质体，能够吸收dna；2、受精后各种生命活动十分旺盛，细胞dna与rna的合成很活跃 此时，外源dna片段的结构、功能与受体基因组及其代谢有一定相容性时，就有可能被整合进入受体基因组，并且可能表达和遗传。花粉管通道技术可用于单子叶或双子叶的任一开花植物这项技术于1978年开始在棉花和水稻上进行实验；如棉花在自花授粉24h后，从子房顶端注入dna；水稻则在自花授粉

8、1 3h将dna溶液滴入切去柱头的花柱切口处 转化成株率一般达到1 10 % 。二、花粉管通道技术的分子验证 1缺口翻译技术验证。 以3h标记海岛棉“416” dna分子(50kb)，于自花授粉后24h，用50l微量注射器向受体(岱字棉滤选204)子房注射10l 3h-dna。 综合分析表明，花粉管道是外源dna进入受体的惟一通道：外源dna经过天然的花粉管通道而进入胚囊，转化种胚细胞。 2通过不同克隆的基因或特异dna片段的导入进行分子验证。 翁坚等应用m13(mp7)与受体重复顺序重组分子导入海岛棉，至胚发育60d，取成熟种，提取dna，以32p标记m13(mp7)制备探针。 从south

9、ern blot的sau 3a酶切图谱上证明通过花粉管通道技术，mp7dna已整合进入受体基因组，而未经外源dna导入的海岛棉dna对照中未测出mp7的同源dna。、3质粒与受体共同顺序重组验证。 应用质粒pne0105(kan，能在植物中表达)与受体的共同顺序(重复顺序)重组后导入棉花与水稻，子代出现了卡那霉素耐性明显高于受体的植株。在水稻中巳测出强的卡那霉素磷酸转移酶的活力同时还在southern blot图片上显示出卡那霉素抗性基因的杂交条带，证明外源基因导入成功，第四节 植物分子育种的兴起与发展据统计，全国约有21个省市，40个以上的实验室开展这方面的研究，优质，高产，抗病，抗逆的优良

10、新品种和新品系不断涌现，显示出巨大的生产力效应。从70年代中期到90年代末，分于育种经历了20余年的艰苦探索。这期间，一共召开了3次植物分子育种学术讨论会，分子学、分子遗传学和作物育种学的专家们汇聚一堂，总结交流经验、切磋技艺、共商发展，使植物分子育种事业进入了新阶段，总的来说，植物分子育种第一层次的技术，即带目的性状的外源dna导入技术，目前已为广大育种家们所接受，它克服了常规育种的局限性，打破了物种隔离的障碍，缩短了育种时间，为生产提供了一批优良品种。第五节 植物分子育种与作物遗传改良育种实践证明，育种上要有新突破，目前必须抓住两项工作：广泛搜集有益的种质资源，并加以利用。 育种方法上进一

11、步革新。20余年的实践证明分子育种与常规育种紧密结合，相辅相成，使作物遗传改良的研究登上了新台阶，优良新品种层出不穷。以下简要介绍这方面的研究成果。一、增强抗性1.抗病（1）棉花 棉花病害，特别是枯萎病、黄萎病等毁灭性病害，常常给生产带来巨大的损失，由于丰产、优质和抗病等性状之间往往存在负相关，常规育种难以打破这一局面，采用分子育种法可以逾越这一障碍，创造极丰富的变异来源，为农作物抗病育种开辟了一条新途径 黄骏麒等 以海岛棉7124作供体，陆地棉910l为受体，将前者dna导入后者，选育出新品系3118，高抗枯萎病，并耐黄萎病，中早熟，生育期l20d左右；在抗病性鉴定中表现高抗枯萎病，其枯萎病

12、病指明显低于受体，与供体相近。3118棉不仅抗病性强而且生产潜力也不错。在江苏和上海大面积示范种植，表现稳产，一般比当地对照品种增产10以上。于元杰等 以鲁棉6号为受体，将罗布麻的dna用微量注射器从幼铃顶端纵轴向下插入胎座约0.5cm处，每铃注10uldna，经过各项鉴定和检测分析，获得一系列优良的变异系如种质系91003，不仅表现高产、纤维品质好，而且在历年棉花枯萎病鉴定中，显示出良好的抗性比推广的抗病品种中棉12号抗病性强另外，于元杰等还以红麻为供体，将其dna导入鲁棉6号，从变异后代中选育出优质、抗病优质系91006，不仅品质优、丰产性好，而且也具有较强的扰棉枯萎病的能力。（2）小麦

13、小麦白粉病对生产的危害也很严重从小麦资源来看，缺乏抗白粉病的亲本。阎新甫、刘文轩（从1988年开始）应用花粉管通道法将抗白粉病的二棱大麦总dna导入小麦感病品种花76(农艺性状好)。研究发现：d1代便出现了277的高抗白粉病变异株；d2代有5个株系的抗性已经稳定。d3和d4代作病菌接种鉴定，表现高抗0、1、11和15号小麦白粉病优势小种。通过侵染型基因测定，表明所获得的抗自粉病基因与小麦中已知的定名抗性基因完全不同，而与大麦的抗白粉病基因一致。于元杰等 采用牛胸腺dna，小麦异属植物披碱草(高抗白粉病和锈病)、小麦品种京花1号(无芒，中抗白粉病和条锈病)等材料作供体，取其dna分别导入受体普通

14、小麦品系814527。该品系丰产性较好，但中度感染条锈病和白粉病。经过培育与选择从不同组合中分别选出了既丰产优质，又抗病的品系。 例如d041新种质系，以小麦841527为母体，导入牛胸腺dna，从其变异后代中经系谱法选育而成d041不仅早熟，而且高产、优质，同时高抗条锈病和干热风。 d259为另一优良选系，其受体仍为814527，供体为京花1号dna。此选系品质优，蛋白质和较氨酸含量均高，前者14%以上，后者0.36。突出的特点是高抗条锈病，叶锈病和白粉病，此外还能抗旱 在以披碱草dna导入814527的后代中也选育出高抗条锈病的新品系d1704。 倪建福等应用花粉管通道技术将长穗偃麦草总体

15、dna直接导入小麦甘麦8号，获得了具有供体性状的后代其中就抗条锈病田间鉴定来看，d2选出两个变异株系，共57个单株，除1个单株感染条锈外，其余56株均表现高抗或免疫。（3）水稻稻瘟病和白叶枯病是危害水稻生产最普遍和最严重的病害。陈善葆、段晓岚等（于1987年）利用花粉管通道技术将抗白叶枯病水稻品种早生爱国3号和矢祖的dna导入受体856403等11个粳稻感病品种，共获得种子671粒次春播种，其中有9个受体的13个组合长成d1代233株。这项研究充分说明供体的抗白叶枯病和其他性状基因，在受体于代中得到了整合、表达和稳定遗传。黄兴奇等 以抗稻瘟病的陆稻品种勐旺谷、云南药用野生稻和燕麦作供体，采用孕

16、穗期茎注射法，将上述各种供体的dna分别导入水稻感病品种西南175，获得了一批性状变异，并能稳定传的后代。 在所归类的19个材料中，经多次鉴定、筛选，共选出7个稻瘟病抗性株系。 2.抗逆性农作物经常受到各种不利因素如盐碱，干旱，水涝、寒冷及特殊金属离子的威胁，一般情况下造成减产，严重时颗粒无收。因而选育对不良环境具有特殊抵抗能力的新品种具有十分重要的意义。 植物分子育种有利于解决上述问题。 （1）水稻 李遭远等 利用广西药用野生稻gxl722、gxl723、gxl686、gxl838和普通野生稻gx0803作供体，以不同类型的栽培稻品种(籼釉稻工11个，粳稻1个)作受体，应用花粉管通道技术将药

17、用野生稻dna导入栽培稻。选育出糯稻桂d1号，耐旱，耐瘠，苗期抗寒，成热期抗早衰产量高，现已大面积推广。（2）小麦 于元杰等 应用浸滴法将小麦供体京花l号dna导入受体814527品系，通过系谱法育成d259品系该小麦品系分蔡性强、长势旺、抗逆性强，对肥反应敏感；高产、优质、抗病，抗干旱，在未浇水的早地试种，表现良好（3）棉花 吴小月应用授粉后外源dna导入技术将中棉常热黑子的dna导入受体陆地棉品种岱红岱，成功地育成了一个高产，优质，吐絮集中、抗逆性强、耐溃涝并耐枯萎病的棉花新品种湘棉12号，1989年已通过湖南省晶种审定。 于元杰等 在棉花分子育种研究中将罗布麻dna导入鲁棉6号，育成抗虫

18、，抗盐种质系91015经中国农科院棉花研究所鉴定，在其他供试棉花品种的棉铃虫虫株率高达100的情况下，该种质系的虫株率仅为26，7，表现了良好的抗虫性该系对盐碱的抗性也较强，试验表明在土壤含盐量高达0.6的条件下能正常出苗 1993年在山东无棣县盐碱地(含盐量0.5x一0.55)试种，出苗率为75.5，皮棉每667m2产65.7kg，从同一组合所获得的另一棉花种质系91010，表现抗盐、高产、优质等特点，91010在抗盐性盆栽鉴定中，在土壤含盐量达0.6%的条件下，出苗正常；用0，6nacl溶液授种发芽检测，在其他棉花品种不能正常发芽的情况下，其发芽率仍高达85.6。1993年在无棣县盐碱地(

19、含盐量0.50.5s)试种，出苗率为67，每667m2产皮棉5.45kg。网上消息（摘自经贸信息） 我国科学家培育成功海水浇灌作物中国科学家近日宣布（2003-6-11），他们已在全世界首次成功培育出可在海滩上种植、用海水直接浇灌生长的作物，并已将种子传到第四代。 这项我国重点科技攻关项目已通过国家验收。主持该项目的海南大学教授林栖凤说，他们将耐盐植物分子通过花粉管通道导入西红柿、茄子、豇豆、辣椒四种淡水蔬菜中，大大提高了它们的耐盐性。验收组组长余诞年指出，经过十年研究，这项技术基本成熟。科技部、农业部和国家海洋局决定向全国逐步推广种植。 著名科学家、分子育种理论与技术创始人周光宇教授称，这一

20、巨大成果对解决淡水资源严重匮乏、人口爆炸、耕地日趋减少的世界性难题，具有开拓性的时代意义，“为国际耐盐植物分子育种的发展作出了跨世纪贡献。”目前，美国、日本等国的科学家也在进行相同研究，我国科学家的成果被认为处于领先地位。美国康奈尔大学教授、著名生物学家吴瑞评价说，海南耐盐植物分子育种的成功意义重大，“在国际上尚未见到有同类报道。”记者在位于海南的试验基地看到，耐盐蔬菜种植在亩海滩上，用百分之百海水浇灌。 除海水浇灌外，耐盐蔬菜只需施少量肥料，成本低。种植方法与淡水种植一样，产量相当。海南地处热带，一年可种三茬。验收结果显示，耐盐蔬菜的营养成份与淡水蔬菜无异，滋味则更好。这项研究有三个国内外首

21、创：一是将海水植物红树的总基因导入淡水植物；二是直接用海水浇灌；三是高耐盐性。 二.提高产量、改良品质 在育种中值得注意的是在综合性状优良的基础上，将高产与优质结合起采，自然还要考虑抗性和适应能力，这是选育新品种的总趋势。 随着人民生活水平的提高，对各种作物的品质提出了更高的要求，忽视了这一点，虽育出了高产品种，但其品质未达要求，也难以在生产上推广。 实践证明，通过分子育种的手段可以很好地将两者结合起来，选育出生产上受欢迎的既高产又优质的新品种。（1）棉花 棉花是纺织工业和人类衣着的主要原料，棉纺工业对棉花纤维品质的要求主要考虑纤维长度、整齐度、细度、成熟度和强度。于元杰等 从红麻dna导入鲁

22、棉6号的后代中选育出91006优质、抗病品系，其品质明显优于受体和对照品种中棉2。抗棉花枯萎病，丰产性也较好。在鲁棉6号+罗布麻dna的组合后代中也发现一些综合性状好，抗逆性强的优质品系如91013。这个品系衣分高，纤维的长度，细度和强度均优于鲁棉6号和推广品种中棉12号。（2）小麦小麦籽粒的品质也是育种家们当前极为重视的问题。籽粒品质涉及到营养品质和加工品质。前者要求蛋白质含量高，而且各种氨基酸的比例要适当，特别是要富含赖氨酸；后者指出粉率，面粉色泽。烘烤品质等，以往在小麦育种上多重视产量的提高，面对品质注意不够，近年来对小麦籽粒的品质提出了较高的要求有的单位应用外源dna导入的方法进行了研

23、究，收到很好的效果于元杰等 将牛胸腺dna导入814527晶系，从其后代中选育出d041品系， 表现优质(高蛋白质，高赖氨酸)，高产、且早熟，抗病其蛋白质含量达到15以上，赖氨酸含量为0.39，蛋氨酸含量0.25（3）水稻 富威力等 采用水稻的近缘属菰的dna导入水稻品种北陆128等8个品系，这些品系在生育期，抗病性和品质方面需要加以改良。据分析供体菰籽粒的蛋白质含量一般为13.4l，受体水稻则较低(9.31)，d1代变异株慕的蛋白质含量多介于两者之间，为8.50一重3.86。赖来展等以蛋白质含量高(14.03)的黑米品种作供体，以高产品种单引1号和白米品种化杀组合杂种f1为受体，采用花粉管通

24、道法，获得稃色及米皮色变异d4代个别株系表现为稳定的黑米稻；d5代稳定的黑米株系达到50。 这种黑色性状在后代中不断积累加强 从d3代便选出黑米高蛋白品系，蛋白质含量达到13.75%； 说明色素和高蛋白的遗传信息均已进入受体基因组，得到了整合与表达。每667m2产量可达325kg，比供体提高30%此品系集天然色素，高蛋白、高产于一体，为黑色保健食品工业的发展提供了新原料。 万文举等 应用浸胚法将慈利玉米dna导入水稻品种湘早籼8号，获得了大量变异后代，从中选出高产、抗病抗逆性强的新品系ger-1。 洪亚辉等 以玉米dna浸泡早稻91-l，从其后代中选个优良变异品系； 如dh系列，每667m2产

25、量超过500kg稻米品质经中国水稻研究所检测，绝大部分项目达米质一级标准，其中蛋白质含量为135左右，最高的达到14。9。另一优良品系的来源是以水稻鄂宜105为受体，密穗高梁dna为供体，采用花粉管通道法进行遗传转化，经过多代严格筛选和检测，选出了矮秆、优质、抗病，抗逆性强的水稻新品系dh3和高产、优质、抗病的水稻新品系dh5。小结经过科学工作者的艰辛探索，植物分子育种在品种的遗传改良和创造新类型方面已作出了巨大成绩 分子育种能巧妙地打破物种界限；育种工作者可以深入到自然界，广泛搜集和利用有益的遗传资源，从而为丰富后代的遗传基础创造条件大量实践证明，开展分子育种，可以解决常规育种难以克服的困难

26、，培育出符合需要的新品种。值得重视的是分子育种必须与常规育种相结合，才能相辅相成。雷勃钧等 利用花粉管通道技术将高蛋白半野生大豆dna导入栽培大豆。 实验结果表明后代变异涉及到成熟期，种皮色泽和蛋白质含量等方面。 d8807组合(黑农26+含早熟血缘的绥农8号dna)，在d2代便分离出3个早熟株系，与受体相比，成熟期提早15d，从d3代起便稳定遗传。 d90-1072品系产量比对照品种提高191； d8701组合(受体黑龙35+龙79-3433-1)，后代有4个株系蛋白质含量比受体提高了l2个百分点； d8705组合(受体虎林绿草豆，供体龙79-42044)在d2代发生疯狂分离，株系间蛋白质含

27、量有差异，均普遍高于受体，最高的比受体提高6个百分点。各性状从d4代开始稳定。总dna导入的后代出现大量变异。 但是：dna到底以什么状态进入受体?进去的是dna片段，还是基因?它们又是如何进入受体基因组的? 实际情况目前尚不清楚因而目前总dna导入还带有很大盲目性。在总结成绩和经验的同时，应逐步转入分子育种的第二个层次：从分子水平上识别和分离目的基因，进而构建重组体，并将该基因准确地送入到受体细胞，与其基因组相整合。第二章 植物dna的提取与检测目前，国内外已有许多dna提取方法：有较为通用的；有专门针对含较高多糖、多酚等次生代谢植物的；有针对具体物种的，如棉花、甘薯、莲属植物等等。不管采用

28、哪种方法，应该考虑到以下几点：第一，如果需鉴定的材料数量有限，就应采取dna微量提取方案；第二，如果材料含有较多的类萜、丹宁、多糖等，就应在dna提取中考虑是否能控制住这些物质对限制性内切酶或pcr聚合酶的抑制作用；第三，如果采用pcr分析，dna提取步骤越少越好，这是因为pcr反应极其灵敏，多步骤及多种试剂容易引起交叉污染，从而影响pcr分析的准确性。第一节 植物总dna提取方法一、植物总dna大量提取方法 二、植物总dna微量提取方法三、植物总dna稍大量提取方法含多酚类材料的dna提取方法以棉花为例；1.取新鲜棉胚3g，加5ml预冷95%乙醇于研钵中匀浆。(04)2.取匀浆液再加5ml乙

29、醇和10ml乙醚，搅拌3060rnin后弃上清;3.取沉淀粉加20ml丙酮，搅拌l2h后，弃上1清液；4.取沉淀物，再加少量丙酮液脱水，重复3次(适温干燥或抽真空)；5.脱脂丙酮干粉，加30ml 0.4mol nacl，稍加搅拌后，4000r/min离心5min后，弃上清液；6.洗涤物，加1015ml 12molnacl，l15mlsds液，搅拌l2min后，4000rmin离心l0min，弃沉淀；7.取上清液，加2倍体积预冷乙醇，沉淀核酸-蛋白复合物，8.沉淀或细丝，加1ml 0.14mol nacl，0.1mol edta，0.1moltris·hci缓冲液，ph 8.2；6l0

30、mg蛋白酶，37继续保温15min；9.消化液加nacl，使终浓度为12mol，37继续保温30min后，加sds使终浓度为l2，37继续保愠15min，4000rmin离心15min；10.取上清液，加乙醇沉淀桉酸，沉淀或细丝溶于5ml 2molnacl，再加乙醇沉淀核酸，重复2次，最后溶子3ml 2molnacl；11.4000rmin离心15min；12.取上清液用sepharose-4柱层析，2molnacl洗脱获纯化dna液。再检测后待用第二节 植物细胞核dna提取方法 第三节 植物细胞器dna提取方法线粒体dna（mtdna）、叶绿体dna（ctdna）第三节 核酸分子的纯度检测及

31、处理获得纯度达到一定程度的核酸分子是分子操作成败的关键。事实上，分子操作的每一步都要进行监控。核酸分离出来以后，便要对其纯度和浓度加以检测dna和rna都是由大量的杂环碱基核苷酸组成的多聚体分子，杂环的紫外吸收特性使dna和rna分子在260nm波长处有强烈的吸光峰。利用这一特性对dna和rna的浓度与纯度进行检测。在核酸分离过程中，污染核酸的主要物质为: 细胞内含物如蛋白质、多糖以及提取药剂如苯酚。 尽管这些污染物在提取流程中进行了针对性的控制，当控制不够充分的情况下，污染便会发生。蛋白质由于含有芳香族氨基酸残基，也具有紫外吸收特性，但其吸收峰值为280nm;苯酚的紫外吸收也在这一峰值; 所

32、以核酸分子中蛋白质和酚的污染情况可以通过比较260nm的吸光值和280nm的吸光值得出。一、核酸浓度的检测(一)紫外吸收光谱法 核酸浓度的检测最常用也是最方便的方法是紫外吸收光谱法。 核酸溶液260nm的od值为1时，相当于大约50gml双链dna，40gml单链dna,或rna，或约20gml的单链寡核苷酸。进行紫外吸收光谱法检测核酸要获较准确的浓度：一要避免核酸分子的相互污染。例如dna中混有rna或寡核苷酸或者rna存在有dna，二要对核酸样品进行适当的稀释。使测定的od值在与浓度呈线性关系的范围内，如0.020.5范围内。检测出od260后，核酸浓度可由下式计算出：dna浓度(gml)

33、=od260×50 ×稀释倍数 rna浓度(gml)=od260×40 ×稀释倍数寡核苷酸浓度(gml)=od260×20 ×稀释倍数(二)电泳比较法 是利用dna嵌入溴化乙锭分子受紫外激发，发出荧光，发射荧光的强弱与dna量成正相关，通过与标准dna样品荧光强度的对比来判断样品dna浓度的一种定量方法。进行电泳比较法dna定量，要制备标准浓度的dna。如利用-dna或鱼精dna，溶解成梯度0、2、5、5、10、20、30、40和50mgml，将一定体积的标准浓度dna和待测样品点样以含溴化乙锭(0.5mgml)的0.8%琼脂糖凝胶中

34、，经过电泳后，拍摄dna荧光带，比较得测样的荧光与标准dna荧光的强度推测出其dna含量。(三)紫外吸收薄层扫描法 紫外吸收薄层扫描法综合了上述两种方法： 先通过凝胶电泳将dna在琼脂糖中分离开来，然后用薄层扫描仪测定紫外吸收od260，吸收波的面积即反映了dna的浓度，这一浓度通过与标准dna峰面积的对照计算即可以得出dna浓度的绝对值。 这一方法不受dna中混有rna或多合dna分子共存的限制，只要能用电泳将它们分离开来都可适用。 二、dna纯度分析蛋白质和苯酚在280nm有吸收峰，会使受污染的dna紫外吸收值od260od280明显下降。因为，dna纯品od260od280=1.8 rn

35、a纯品od260od280=2.0所以，od260od280<1.8， 即表明dna中含有蛋白质或苯酚，需要进一步纯化，如果，od260od280>2.0，即说明dna中有rna或者降解寡核苷酸等的污染 三、dna的进一步纯化 dna的进一步纯化，首先要弄清其中污染了哪种物质。如果是蛋白质的污染：先以te将dna稀释至0.1ugml左右，加入终浓度为0.5的sds和12.5ugml的蛋白酶k，50保温1h后以氯仿:异戊醇抽提两次，然后加入终浓度0.3mol的naac和2倍体积的乙醇沉淀dna，dna沉淀的70乙醇洗一次后干燥，溶解如果dna样品中混有苯酚：可以氯仿：异戊醇抽提二次，

36、将苯酚抽除，再以乙醇沉淀和干燥等。如果样品中混有rna：先经rna酶酶解，然后再抽提、乙醇沉淀，对于寡核苷酸、多糖等的污染则要通过层析法或凝胶电泳将其除去第三章 植物外源dna的导入方法外源dna的导入：是指通过某种特定的途径将外源基因或外源dna片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。它是分子育种的一个重要技术环节。经过10多年来的研究，巳建立起了10余种不同的导入方法。按技术属性可将它们分为物理法、化学法及生物法三类。物理法: 如基因枪法、电激法、注射法、激光穿刺法，超声波法，碳化硅纤维法等；化学方法: 聚乙二醇(peg)法，磷酸钙-dna共沉淀、脂质体法等.

37、生物法:农杆菌法，花粉管通道法，浸渍法，病毒法等如果按照媒体类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法三类。 载体介导法（间接转移系统）:是将目的dna转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染面将目的dna导入植物细胞中。 直接导入法（直接转移系统）:是以裸露的外源dna通过化学或物理方法直接导入植物细胞，它主要包括前面所说的化学方法和物理方法。 种质系统介导法（生殖细胞转移系统）：是借助植物自身的种质细胞与媒体(如花粉，卵细胞，子房，花粉管通道、幼胚等)来实现外源dna导入的方法它包括花粉管导入法，子房，幼穗、幼胚注射法，种子漫渍法等。第一节 农杆菌介导法利用农

38、杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或dna片段插入ti质粒的t-dna中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。t-dna转移的过程可简要地概括如下： 损伤的植物细胞产生乙酰丁香酮等植物酚类物质作为农杆菌的侵染信号； 这些化学诱导物(又称信号分子)透过农杆菌的细胞膜激活vira和virg基因，再激活vir区的其他基因；这些vir基因活化后，其产物对t-dna进行加工、剪切，并引导t-dna整合进植物基因组， t-dna在植物细胞中表达产生植物激素，刺激植物形成肿瘤。转化程序：植物受体系统的建立、ti质粒转化载体系统的构建、工程农杆菌的制备、外源基因的转化、转化体的筛

39、选和转基因植株的检测等一系列步骤。第二节 基因枪法基因枪法，又称：微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击：是一种借助高速金属微粒将dna分子引入活细胞的转化技术。最早是由美国cornell大学的sanfrod等(1987)研制出火药引爆的基因枪。klein等(1987)首次在洋葱上对细胞进行试验，将氯霉素乙酰转移酶(chloramphericol acetyl transferase，cat)基因导入洋葱表皮细胞1990年美国杜邦公司推出了pds·1000型商品基因枪，此后，高压放电、压缩气体驱动等各种类型基因抢相继出现，并都在实际应用中得到了不断的改进和发展，开创

40、了基因转化技术的新局面，使基因枪转化法成为继农杆菌介导法之后又一广泛应用的转化技术。第三节 peg法聚乙二醇（polyethyleneglycol，）法是从促进原生质体融合的方法中衍生出来的，于1980年由dave等首先建立 pazkowski等(1984)报道了第一侧用peg法转基因成功的植物 后来随着单子叶植物原生质体分离培养的植株再生技术的发展,peg法转化植物成功的报道已越采越多。其方法本身也随之得到很大的改进，转化率已达到了现在的10-2甚至更高，已成为了一种常用且比较成熟的植物原生质转化方法基本原理 peg是一种选择性化学渗透剂，分子质量可从150012000，ph从4.66.5，

41、因多聚程度不同而异。 它可以使细胞膜之间或使dna与细胞膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为peg诱导法。 peg诱导所引起的细胞膜透性改变是可以恢复的。 在peg转化过程中常需加入ca2+离子，这种二价阳离子可与dna结合成dna-磷酸钙复合物而使dna沉积于原生质体的膜表面，并促进细胞发生内吞作用 此外，高ph值可诱导原生质体的融合和外源dna分子的摄取，因此，peg转化时常将溶液ph调到8.0左右，但高于10时则会损伤原生质体。peg法正是利用以上因素作用于植物原生质体，使加在培养液中的外源dn

42、a分子进入细胞而实现转化目的的。第四节 浸渍法 浸渍法：是指将植物的种子，胚、胚珠，子房、花粉粒、幼穗，悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源dna溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。这种方法实际上在经典的基因工程诞生之前就有人开始探索了，这一想法的萌芽是受细菌转化现象的启发，早在1969年，德国学者hess便报道了用外源dna浸泡矮牵牛的萌动种子而出现变异性状的结果。一、基本原理 浸渍法主要是利用植物细胞自身的物质运转系统将外源dna分子直接导入受体细胞。现已证明植物细胞至少可以通过以下几种途径将外源dna吸入细胞内： 外源dna可以通过细胞间隙与胞间连丝组成

43、的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内； 植物细胞也可以通过类似动物细胞的内吞作用将外源dna摄入细胞内；植物组织中细胞的膜透性改变也可以为大分子物质透过细胞膜提供机会，尤其是在生殖细胞、胚胎细胞以及分生细胞中，外源dna进入细胞中的机会更大。二、基本方法 浸渍法，就是将不同的受体系统直接放入供体dna(包括总dna和质粒dna)溶液中浸泡一段时间，再经过自然发育或人工培养面得到转化植株。以种子为受体的基本操作方法：1.将种子用0.1的升汞或2030次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮(也可剥出幼胚)；2.将剥出的种子浸于无菌的0.1×ssc缓冲液中，加入20的二甲基亚砜(dmso)；3.加

44、入供体dna溶液(100200gm1)，浸泡30min至数h； 4.用无菌0.1×ssc缓冲液冲洗干净；5.将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，转入无激素的固体培养基上培养；6.将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选(用质粒dna浸泡的种子)，或成苗后转载到土壤中进行变异性状分析(用总dna浸泡的种子)。三、基本特点 浸渍法是高等植物遗传转化技术中最简单，快速，便宜的一种转化方法它不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且此法容易推广普及。 但该法的转化频率较低，重复性较差，筛选和检测也困难，往往很难得到分子生物学证据。第五节 花粉管通道法花粉管通道

45、法：是利用植物受精过程中形成的花粉管通道将外源dna导入植物的技术。 是由我国学者周光宇提出并建立的一种非常实用的转基因技术 这一方法也在实际应用中得到了不断的发展和完善，成为分子育种最有价值的方法之一。 一、基本原理授粉后外源dna能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。周光宇等认为在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期。因为：（1）精、卵细胞类似天然的原生质体；（2）在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；（3）合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力也较小：（4）雄配子体花粉萌发

46、时，顶部也拥有无壁的小孔，外源遗传物质也容易吸入二、操作方法利用花粉管道道导入外源dna的技术已发展出多种行之有效的操作方法，基本归纳为三类：1.柱头切除法：当受体植物自花授粉一定时间后(一般23h）切去花柱； 然后马上在切口上滴入供体dna溶液，浓度为50100ug/ml，溶于1xssc(150m molnacl，15m mol柠檬酸钠，ph7.5）；最后套袋隔离至种子成熟。2.花粉粒吸入法： 收集新鲜花粉加入到供体dna溶液(0.3mol蔗糖、20mmol硼酸钠，dna终浓度40ugml)中，混匀，使外源dna被吸入花粉粒；然后取混合液滴于预先去雄套袋隔离的雌蕊上进行人工授粉；再继续套袋至

47、种予成熟。3柱头涂抹法： 在未授粉前先用dna溶液涂抹柱头，然后人工授粉套袋隔离，通过花粉管的伸入将外源dna带入胚囊，成熟后收获种子 上述各种方法的操作程序中，都要设置以不含dna的等量ssc溶液作相同处理为对照所有获得的处理与对照的种子均需点播在同一试验田进行田间鉴定和筛选三、基本特点 花粉管通道法是利用自然繁殖过程中整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞作为转化受体，无需细胞，原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。 这样，就避免了原生质体再生以及组织培养过程中可能导致染色体变异或优良农艺性状丧失的问题。 且此方法不受植物种属的限制，在具备有性生殖过程的任何植物上都能应用 另

48、外，此法简便，易于掌握，可以在大田，盆栽或温室中进行，育种时间短，筛选遗传稳定的品系一般只需34代时间， 再者，通过外源总dna片段的导入可以了解一些具有重大经济价值的农艺性状是否能够通过dna片段进行转移、这些性状是单基因性状还是多基因性状，从而能为目的基因的克隆提供参考和材料。 但此法的使用在时间上受到开花季节的限制，而且应用总dna片段的导入，筛选到的子代可能带有目的基因以外的dna片段 总之，目前花粉管导入法已有了一定的理论基础和大量的实践证实，它的简捷特性以及可以直接得到转化种子等优点使之成为目前广泛使用的转化方法之一第六节 显微注射法显微注射： 是利用显微装置将大分子物质或细胞器注

49、射到培养细胞的一项技术。 该技术历史悠久，最初主要用于两牺类动物的核移植以及哺乳类和鱼类卵细胞的遗传转化。 近年来，植物悬浮细胞、花粉粒以及多细胞结构的分生组织、胚状体等都被用作显徽注射的受体材料，并使该方法在理论上和技术上都有了进一步的发展 。一、基本原理 其基本原理是利用显微注射仪将外源dna直接注入受体细胞，并使其成活、增殖而发育成为转基因个体。 显微注射中的一个重要环节是固定受体细胞，目前采用的固定方法有三种： 脂糖包埋法。多聚-l-赖氨酸粘连法。吸管支持法。二、操作步骤 1.注射微针的制备2.受体材料的制备和固定3.受体材料的显微注射4.注射后的细胞培养三、基本特点 显微注射法的突出

50、优点是转化率高，有研究表明，它的瞬时表达频率可达30或更高，这是其他方法所不及的 另外，它是一种纯粹的物理方法，能适用于各种植物和各种材料。 最近有人利用改良后的这一方法对植物的子房，穗颈等进行直接注射，也获得了理想的结果。 再者，此法的整个操作过程对受体细胞无药物毒害，有利于转化细胞的生长发育。其缺点是操作繁琐耗时，工作效率低，并需要精细的操作技术和精密的仪器设备，难以进行大批量的转化工作第七节 电激法电激法也称电穿孔法：是利用高压电脉冲作用使细胞膜上形成可逆性的瞬间通道，从而使外源dna分子进入细胞的转化方法。此法是80年代初发展起来的，最初主要用于原生质体的转化。一、基本原理 细胞膜主要

51、由脂类组成，每一个脂质分子都有极性的头部和疏水的尾部，因此细胞膜可以视为一种电容，其静息膜电位(vm)约为100mv。 当细胞处于一个外加电场中时，膜电位增高，即v>vm。v的高低与电场强度(e)成正比。随着e的不断增大，v也不断升高，于是膜被压缩变薄。 当v升高到一定值时，膜被击穿形成微孔，此压称之为击穿电压(vc) 如果电场强度不再继续增大，此时所形成的膜孔数量少、孔径小，间隔一段时间后即可复原，这称之为“可逆击穿”。 对受体细胞施以可逆击穿电场强度即可达到电击穿孔转化的目的二、基本特点 电激法在转化原生质体上取得了良好的效果，已被国际上公认为是一种成熟可靠的转化方法。 它除了同样具

52、有peg法的优点外，还具有操作简便、转化效率较高的特点，特别适用于瞬时表达的研究。 另外，这种方法无宿主的限制，对胚性愈伤组织、悬浮细胞，分生组织均可采用。并有研究表明，此法与peg法结合使用，可大大提高转化频率。 其缺点是易造成细胞膜的损伤，使植板率降低，而且仪器也较昂贵，各项转化参数还有待进一步的优化。第八节 超声波导入法超声波导入法：利用低声强脉冲超声波的物理作用将外源dna分子导入细胞的一种转化方法， 我国学者最早建立并应用该技术将外源基因导入植物细胞。一、基本原理超声波是指频率为2×10 42×109hz的声波，它的生物学效应主要是机械作用，热化作用和空化作用。热

53、化作用：生物组织在超声机械能的作用下由于粘滞吸收，将一部分超声被转化为热能，使生物组织的愠度上升，称之为超声波的热化作用。机械力作用：由于生物组织大多数属软组织，因而在超声波的机械力作用下，其细胞质膜发生变形，当超声波的强度增加到一定程度时，细胞膜就会击穿。空化作用：组织在缓冲液中经超声波处理后，在缓冲液下会形成大量的小气泡这些小气泡在湮灭过程中产生高温及高压，甚至产生电离效应，而导致细胞壁与质膜的击穿或可逆的通透性的变化。 这些因素将使得外源dna进入到细胞中。二、基本特点 超声波转化方法不受受体种类的限制，不仅适用于原生质体，而且适用于带壁细胞的转化，并且操作简单、转化效率高，不失为一种很

54、有应用潜力的转化方法但该转化方法外源dna用量较大，另外还有许多参数有待于优化。第九节 激光微束法 激光微束法：利用激光微束使细胞壁和细胞膜穿孔，从而将dna导入细胞的方法。1984年tsukakoshi等这种方法对动物细胞进行dna转化试验。一、基本原理激光是一种很强的相干单色电磁射线，细胞膜系统或细胞内的某些结构由于能够吸收特定波长的激光产生热效应而引起某种程度的损伤。一定波长的激光束经聚焦后到达细胞膜表面时其直径大约只有0.30.5nm。这种直径很小，但能量很高的激光束可使细胞膜产生可逆性穿孔，利用激光微束的这种穿刺效应可以使外源dna导入到受体细胞中。二、基本特点 激光徽束转化技术同基

55、因枪、电击穿孔和超声波法一样，属于物理转化方法。 其优点是无宿主限制，可适用于各种功能植物材料和各种类型的受体细胞，并且操作简单、方便，转化效率较高，每分钟可操作100个左右的细胞，比显微注射法效率提高20倍，比化学法提高三个数量级； 另外，还可进行细胞器的基因转化，由于激光微束小于细胞器，它可以在显微水平上直接对细胞器击孔，实现外源dna对细胞器的转移 但其需要昂贵的仪器设备，转化频率只有10-210-4。其稳定性和安全性目前还不如电激法和基因枪法第十节 碳化硅纤维介导法碳化硅纤维介导法是由美国明尼苏达州立大学kaeppler等(1990)首先建立起来的。 一、基本原理 碳化硅是一种单晶硅，

56、平均直径为0.6um，长度为直080um。这种纤维具有很高延展强度，其物理特性类似于石棉，表面光滑、不易结块。 将它加入到含有受体细胞和外源dna的转化液中混合振荡，在相互碰撞中，纤维丝可对细胞产生穿刺作用，那些粘附于纤维丝上或细胞壁上的dna将随之进入细胞，而完成转化作用 值得注意的是，碳化硅纤维吸入肺部容易引起伤害，因此应在通风柜中进行操作，一般先配成5%的悬液备用，以减少它往空气中的飘逸。二、基本特点 碳化硅穿刺技术具有简便、快速，成本低的特点，而且单子叶及双子叶植物均可采用，不需要昂贵的设备，可以转化完整细胞和组织。 但这种方法尚不够成熟，转化组织快时，多只对表层细胞有效，尚有许多参数有待进一步优化。 另外，穿入细胞的