疟原虫镜检血片的制作与染色

1、疟原虫镜检血片的制作与染色1. 材料材料l(1) 载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中1020分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，凉干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中12天，或浸泡于煮沸的5肥皂水中12小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中12小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每1020张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。l(2) 采血针：使用一次性釆血针。l(3) 玻片盒：l(4) 75乙醇棉球：用于采血前后的消毒。l(5) 标签记号笔：用于玻片上书写号码。血涂片的制作

2、血涂片的制作2. 采血部位及取血方法采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75乙醇棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位12mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。l3. 涂制厚血膜涂制厚血膜 取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45l，再用该端中部刮取血液11.5l。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。厚血膜外观：

3、圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。l4.推制薄血膜用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持2535角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕。位置：位于玻片1/21/3处。l5. 厚、薄血膜的位置厚、薄血膜的位置 每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图5. 染色前血膜的保存染色前血膜的保存l血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。l血膜放置时间，夏天不宜超过4

4、8小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中12小时后取出血片。血膜的染色血膜的染色1. 染色液的制备染色液的制备 l疟原虫镜检推荐使用吉氏染液。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。 l吉氏染液配制： 吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至

5、甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 2. 染色用水染色用水 l 常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用pH7.07.2水效果最佳。l可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。配制pH6.67.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。贮备液为每1 000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠，贮备液为每1 000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。配

6、制pH6.67.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。 3. 染色方法染色方法 l固定薄血膜：要用甲醇或无水乙醇；l厚血膜溶血：用蒸馏水或清水溶血。l少量血片染色：取可取蒸馏水或缓冲液8ml加入吉氏染液1012滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色2030分钟，然后水洗、晾干。l成批血片染色：将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2吉氏染液浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗23次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥

7、。8ml血片制作和染色质量评价标准血片制作和染色质量评价标准l好血片制作质量好血片制作质量: : 厚血膜：血量 4.05.0ul,位置 玻片右13稍偏右,直径 0.81.0cm，外观 圆形厚膜均匀。薄血膜：血量 1.52.0 ul，位置 玻片1213处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色；清洁度 外观光洁无油灰。 理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。1.1.涂制厚血膜涂制厚血膜2.2.推制薄血膜推制薄血膜3.3.固定薄血膜固定薄血膜4.4.厚血膜溶血厚血膜溶血5.5.稀释染液及染色稀释染液及染色6. 6. 漂洗漂洗7.7.镜检镜检制作血

8、膜的注意事项l1.刚涂制的血膜要平放，注意防尘、防虫。厚血膜未干前勿使血片倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。l2.血膜应自然干燥。切忌在毒太阳下晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1-3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。l3.厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果。l4.使用前载玻

9、片一定要清洁，不然会影响血片制作和镜检结果。 l5.配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。l6.固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜。l7.冲洗染液时，不要冲走厚血膜。影响血膜染色质量的因素影响血膜染色质量的因素l血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关:l(1) 染剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是否理想，否则需重新制备染液。l(2) 染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱

10、，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前12周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。l(3) 染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。l(4) 染色时间：染色时间长，染色效果好，反之则差。染色时间长短与温度有关，温度高着色快，故染色时间可适当缩短，温度低染色慢，则时间可适当延长。所以染色时间长短要随着染液的质量、新旧、浓度及温度而决定。l(5) 稀释

11、和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.07.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。l(6) 冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉，应将玻片连同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。l吉姆萨（Giemsa）染液由天青、伊红组成。染料中天青是碱性的,伊红是酸性的。染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染色