核酸的分离提取

1、1植物分子生物学实验技术植物分子生物学实验技术颜颜 泽泽 洪洪2主要内容主要内容第一部分第一部分 核酸的分离制备核酸的分离制备第二部分第二部分 pcr技术技术第三部分第三部分 主要分子标记主要分子标记第四部分第四部分 基因克隆基因克隆3（美）dveksler gs and dieffenbach cw. 黄培堂 俞炜源 陈添弥等译 现代生物技术译从 pcr技术实验指南技术实验指南 科学出版社（英） clark ms 主编 顾红雅 瞿礼佳 主译 植物分子生物学实验手册植物分子生物学实验手册 高等教育出版社 施普林格出版社郑成木 主编 植物分子标记原理与方法植物分子标记原理与方法 湖南科学技术出版

2、社brown ta. 魏群等译 国外优秀生命科学教材译从 基因克隆和基因克隆和dna分析分析 高等教育出版社参考书目：参考书目：4第一部分：核酸的分离制备第一部分：核酸的分离制备abc?5第一部分：核酸的分离制备第一部分：核酸的分离制备dna dna 提取是一切分子生物学研究最基础的技术，提取是一切分子生物学研究最基础的技术，高质量的高质量的dnadna是用于是用于pcrpcr和酶和酶切分析等系列后续操作的重要保证切分析等系列后续操作的重要保证发展了多种发展了多种dna dna 提取方法提取方法, ,可从可从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等等多

3、种组织器官中提取多种组织器官中提取dnadna；但不同植物、同种植物材料的不同来源、部但不同植物、同种植物材料的不同来源、部位、形态以及不同化学成分、组织结构特点位、形态以及不同化学成分、组织结构特点差异差异, ,导致导致dnadna 提取提取时需要选时需要选择不同的方法或作一些特殊处理择不同的方法或作一些特殊处理 从富含从富含多糖、多酚、单宁、色素多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取及其他次生代谢物质的木本植物中提取dnadna的的方法难度就相对大于大多数禾谷类及蔬菜类植物方法难度就相对大于大多数禾谷类及蔬菜类植物（1 1）多酚被氧化成棕褐色）多酚被氧化成棕褐色（2 2）

4、多糖、单宁等物质与）多糖、单宁等物质与dna dna 会结合成粘稠的胶状物会结合成粘稠的胶状物, ,获得的获得的dna dna 常出现产常出现产量低、质量差、易降解，影响了量低、质量差、易降解，影响了dna dna 质量和纯度，不能被限制性内切酶质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行酶切，严重的甚至不能作为模板进行pcr pcr 扩增扩增1. dna1. dna在分子生物学研究中的重要性在分子生物学研究中的重要性62. 2. 提取提取dnadna应满足的基本原则应满足的基本原则不同的研究对不同的研究对dnadna的要求不一致，但一般应满足的要求不一致，但一般应满足: :

5、 (1) (1) 排除蛋白、糖类和脂类等物质的污染，排除蛋白、糖类和脂类等物质的污染，dnadna纯度应满足下游操作需要纯度应满足下游操作需要 用于用于rflprflp、aflpaflp应满足酶切要求应满足酶切要求 用于用于pcrpcr的不含的不含pcrpcr的干扰甚至抑制物的干扰甚至抑制物 (2) (2) 所得所得dnadna应当完整应当完整 电泳检测得到清晰、完整、可重复、无降解的条带电泳检测得到清晰、完整、可重复、无降解的条带 保证保证dnadna一级结构的完整一级结构的完整 (3) (3) 足够量的足够量的dnadna 有的实验要求量多（标记）有的实验要求量多（标记）7(1) (1)

6、破坏（消化）细胞壁、释放内容物破坏（消化）细胞壁、释放内容物 在破壁时也会剪切在破壁时也会剪切dnadna，在完整性和产量间折衷考虑，在完整性和产量间折衷考虑 分离总分离总dnadna破壁方法破壁方法 液氮中快速冷冻、研磨成细粉末液氮中快速冷冻、研磨成细粉末 分离核分离核dnadna或细胞器或细胞器dnadna破壁方法破壁方法 更温和的方法、以免过早破坏内膜系统、含渗透剂的缓冲液更温和的方法、以免过早破坏内膜系统、含渗透剂的缓冲液4 4o oc c匀浆匀浆 (2) (2) 破坏细胞膜使破坏细胞膜使dnadna释放到提取缓冲液中释放到提取缓冲液中 通常靠通常靠sdssds或或ctabctab去污

7、剂来完成，保护去污剂来完成，保护dnadna受核酸内源酶降解受核酸内源酶降解 缓冲液通常含缓冲液通常含edtaedta，可螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子，可螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子- -镁离子镁离子3. 3. 基本原理基本原理8（1）植物材料的采集及前处理）植物材料的采集及前处理 尽可能使组织材料保持水分而保鲜尽可能使组织材料保持水分而保鲜（用湿纱布包裹（用湿纱布包裹, ,放置于密闭的冰盒等）放置于密闭的冰盒等） 野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存( (如放置于液氮中如放置于液氮中) ) 不具备冷冻条件时不具备冷冻条件时 无水无水caso

8、4 caso4 的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料 保存数月，返回后尽快提取保存数月，返回后尽快提取dna dna 对具有大量次生代谢物对具有大量次生代谢物( (如丹宁、酚类、醌类等如丹宁、酚类、醌类等) ) 的植物材料的植物材料, ,尽可能采集幼嫩尽可能采集幼嫩组织，冷冻保存、短时间内提取组织，冷冻保存、短时间内提取dnadna 植物组织化学保存法植物组织化学保存法 乙醇、丙二醇处理法乙醇、丙二醇处理法 导致导致dnadna剧烈降解（不推荐）剧烈降解（不推荐） 样品长期保存样品长期保存 液氮处理后贮存在液氮处理后贮存在- 80- 80冰箱或直接储放于液氮

9、中冰箱或直接储放于液氮中 在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化 实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等）实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等） 饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗4. 4. 基本步骤基本步骤9（2）组织（细胞）破碎）组织（细胞）破碎 物理方法 溶涨和自溶; 化学方法 生物酶降解 液氮快速冷冻处理后研磨（推荐）或在提取缓冲液中研磨（不推荐） （3）释放）释放dna 释放dna到ctab或sds类去污剂中、65oc保温处

10、理（4）纯化和浓缩：去除残渣、沉淀）纯化和浓缩：去除残渣、沉淀dna 释放出的dna中含有大量的rna、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质 需用氯仿、苯酚处理后变性、沉淀除去，rna可用rnase除去。 通常采用4oc离心的方法，产生分层，去掉植物残渣、留上清液部分 沉淀通常采用异丙醇（1 volume)、酒精（2 volume) 等（5）洗涤）洗涤 去掉部分色素和盐等，通常采用70%酒精和100%无水乙醇4. 4. 基本步骤基本步骤10（6） dna纯度和浓度检测纯度和浓度检测 0.8%琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法(常用）常用） dna样品在紫外线照射下发

11、出的红色荧光强度与dna的含量成正比 使用标准浓度的dna样品作对照，可以估计出被测dna的浓度 紫外分光光度计检测紫外分光光度计检测 dna在260nm处有一个明显的吸收峰估计浓度 在a260 1od相当于双链dna浓度50 g/ml 根据a260/a280比值估计dna纯度 纯dna 的a260/a280=1.80.1， rna的比值为2.0左右。 1.8 可能有rna未除去 0.7 mol/l nacl) ，可与蛋白质和酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸不能沉淀核酸 因此，ctab可从大量产生黏多糖的植物以及某些革兰氏阴性菌（包括大肠杆菌的某些株）制备纯化的dna，这种去污剂

12、加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中( 0.7 mol/l nacl)，经过连续的酚/氯仿有机溶剂抽提，去除ctab/黏多糖黏多糖/蛋白蛋白质质复合体，异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将dna分离出来 ctab还有提高提高dna互补链复性速率互补链复性速率及稳定已形成的稳定已形成的dna双螺旋的作用双螺旋的作用 ctab法的主要特点是应用范围较广应用范围较广25ctab法法 组组 分分 用量用量终浓度终浓度ctab 20 g 2 % (w/v)1 mol/l tris-hcl, ph 8.0100 ml0.1 mol/l0.5 mol/l edta, ph 8.0200 ml0.1 mol/l

13、nacl 81.8 g 1.4 mol/l-巯基乙醇巯基乙醇 (用前加）用前加） 0.2% (v/v)2ctab 缓冲液（缓冲液（1000 ml)8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理26（1）2g 幼嫩植物组织加液氮并迅速研磨成细粉，置入50ml离心管中缴入预热治65的10ml的2ctab缓冲液，轻摇混匀（2）65水浴2h，轻摇混匀（3） 冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀直至上清液呈牛奶状（4）4000 rpm 离心10min（5）取上清液，加入等体积冰冷的异丙醇沉淀，挑出dna（6）用70%和100%乙醇各洗一次（

14、7）将dna溶于适量的te（ph 8.0)中，加入rna酶（终浓度100g/l）（8）电泳检测或用紫外分光光度计检测dna的浓度和质量ctab法提取植物法提取植物dna步骤步骤8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理278. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理sds法及主要原理法及主要原理sds-sodium lauryl sulfate/十二烷基硫酸钠结构式：ch3(ch2)11oso3na；分子量：288.39， 白色至微黄色粉末，微有特殊气味 一种阴离子去垢剂, 在高温在高温(55-65) 时裂解细胞时裂解细

15、胞，使染色体离析、蛋白变性，形形成成sds /蛋白质蛋白质/多糖复合物多糖复合物，释放出核酸释放出核酸，提高盐(kch3cooh 或nh4ch3cooh) 浓度并降低温度(冰浴)，使 sds - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后除去沉淀；上清液中的 dna 用酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的dna sds 法操作简单，温和，可提取到高分子量的dna ,但产物含糖类杂质较多含糖类杂质较多28sds法法组组 分分 用量用量终浓度终浓度sds 20 g 2 % (w/v)1 mol/l tris-hcl, ph 8.5100 ml0.1 mol/l0.5

16、 mol/l edta, ph 8.0100 ml0.05 mol/lnacl 5.84 g 0.1 mol/l蛋白酶蛋白酶k 0.05 mg/mlsds缓冲液（缓冲液（1000 ml)sharp et al. (1992) theor appl genet.8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理29sds法提取植物法提取植物dna步骤步骤（1）3-5g 幼嫩植物组织加液氮并迅速研磨成细粉，置入50ml离心管中缴入预热治65的20 ml的sds缓冲液及100l蛋白酶k(终浓度0.05mg/ml)，轻摇混匀（2）65水浴2h，轻摇混匀（3） 冷却至室温，

17、加入等体积的酚/氯仿，轻轻上下颠倒混匀（4）3000 rpm 离心20 min（5）取上清液转入到另一离心管中，加入等体积氯仿，混匀后3000 rpm 离心20 min（6）取上清液转入到另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻摇混匀，静置一段时间后，挑出dna, 用70%和100%乙醇各洗一次, 气干（7）将dna溶于适量的te（ph 8.0)中，加入rna酶（终浓度100g/l），37 保温1-3h（8）加入等体积酚/氯仿，轻摇混匀，3000 rpm 离心15 min，取上清（9）加入等体积氯仿，轻摇混匀，3000 rpm 离心15 min，取上清（10）加入1/10体积的3m nach3

18、coona (ph5.2)，混匀后加入2倍体积的95%乙醇，挑出dna, 用70%和100%乙醇各洗一次, 气干（11）加入适量te（ph 8.0)溶解dna（12）电泳检测或用紫外分光光度计检测dna的浓度和质量8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理308. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理离液盐作用变性蛋白和核酸改变水的结构、帮助核酸结合到硅胶膜上溶解多聚糖胶磁珠分离法磁珠分离法硅膜吸附法硅膜吸附法31磁珠法主要原理磁珠法主要原理通过细胞裂解液裂解细胞，游离出的核酸分子被特异核酸分子被特异吸附到含硅胶膜的磁

19、性颗吸附到含硅胶膜的磁性颗粒表面粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中 在磁场作用下使磁性在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开颗粒与液体分开，回收磁珠-dna 混合物，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的dna 8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理32硅膜吸附法主要原理硅膜吸附法主要原理在离液盐的作用下，水的结构发生改变，帮助核酸结合到硅核酸结合到硅胶膜胶膜上，而在无离液盐的作用下，则将核酸进行洗脱洗脱8. 8. 常用植物总常用植物总dnadna提取方法及主要原理提取方法及主要原理339. rna9. rna提取提取rna实验的关键是分离得到全长的rna实

20、验失败的主要原因是核糖核酸酶（核糖核酸酶（rnarna酶）的污染酶）的污染rna酶广泛存在而稳定广泛存在而稳定、一般反应不需要辅助因子。 可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等2. rna的纯度和完整性又可直接影响rna分析的结果,少量少量rnarna酶就会引起酶就会引起rnarna在制备与分析过程中的降解降解难点：一、严格控制外源性难点：一、严格控制外源性rnarna酶的污染酶的污染 外源性的rna酶：操作人员的手汗、唾液等，灰尘等。外源性rna酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽等 二、最大限度地抑制内源性的二、最大限度地抑制内源性的rnarna酶酶 各种组织和细胞中含有大量内源

21、性的rna酶rnarna提取的难点提取的难点341. 1. 杜绝外源酶的污染杜绝外源酶的污染 严格戴好口罩，手套 实验涉及离心管、tip 头、移液器、电泳槽、实验台面等要彻底处理 试剂/溶液，尤其是水，必须确保 rnase-free2. 2. 阻止内源酶的活性阻止内源酶的活性 选择合适的匀浆方法和裂解液 控制好样品的起始量3. 3. 明确自己的抽提目的明确自己的抽提目的 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 rna 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率防止防止rnarna酶污染的措施酶污染的措施9. rna9. rna提取提取35防止防止rnarna酶

22、污染的措施酶污染的措施1. 设置设置rnarna操作专用实验室操作专用实验室，所有器械等应为专用2. 所有玻璃器皿玻璃器皿在使用前于180180高温烘烤高温烘烤6hr6hr或更长时间或更长时间3. 塑料器皿塑料器皿可用0.1% depc0.1% depc水浸泡或用氯仿冲洗水浸泡或用氯仿冲洗 （注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）4. 有机玻璃有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再 浸泡在3% h2o2 室温10min，然后用0.1% depc水冲洗，晾干5. 配制的溶液配制的溶液应尽可能的用0.1% depc0.1% depc，在37处理12hr以上。 然后用

23、高压灭菌除去残留的depc。 不能高压灭菌的试剂，应当用depc处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22m滤膜过滤除菌6. 操作人员操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换9. rna9. rna提取提取36焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（depcdepc）一种强烈但不彻底的rna酶抑制剂。通过和rna酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性异硫氰酸胍异硫氰酸胍目前认为是最有效的rna酶抑制剂，在裂解组织的同时也使rna酶失活,既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对rna酶有强烈的变性作用氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，

24、它和rna酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制rna酶的活性。rnarna酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（rnasinrnasin）从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。rnasin是rna酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种rna酶结合，使其失活其它其它sds、尿素、硅藻土等对rna酶也有一定抑制作用常用的常用的rnarna酶抑制剂酶抑制剂。9. rna9. rna提取提取371. 样本前处理样本前处理 选择新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织 处于生长旺盛的时期收集细胞、新鲜血液，不得超过4小时 液氮或加入rnase抑制剂保存, 避免反复冻融， 推荐使用专门的推荐使用专门的rna样品储存液储存样品

25、储存液储存2. 细胞裂解细胞裂解 异硫氰酸胍/酚trnzol总rna提取试剂 胍盐/-巯基乙醇rnaprep系列rna提取试剂盒 独特配方rna plant植物rna提取试剂3. rna的纯化及获得的纯化及获得 纯化后不应存在对酶 (如逆转录酶) 有抑制作用物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 排除dna分子的污染10. rna10. rna提取流程提取流程38几种几种rnarna提取方法提取方法1. trizol法法 trizoltrizol的主要成分的主要成分: :异硫氰酸胍和酚 异硫氰酸胍异硫氰酸胍：解偶剂，一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质

26、，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放 酚酚：有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制rna酶活性 trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源rnase。 原理：原理：trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总rna的试剂 在破碎和溶解细胞时能保持rna的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水相层和有机层。rna存在于水相层中。收集上面的的水相层后，rna可以通过异丙醇沉淀来还原9. rna9. rna提取提取391 样品处理： 称取 50-100mg 幼嫩叶片（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml trizol 充分匀

27、浆，室温静置 min 2 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 3 4 离心， 12000g 15min ，取上清 4 加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 5 4 离心， 12000g 10min ，弃上清 6 加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ， 7500 g 5min ，弃上清 7. 晾干，加入适量的 depc h2o 溶解（ 65 促溶 10-15min ）o测o.d值定量rna浓度 提取rna a260/a280 值在1.6-1.8之间；产率植物叶片100-200g rna/gtrizoltrizol法提取流程法提取流程9

28、. rna9. rna提取提取40植物组织植物组织基因组基因组dna水相有机相rna氯仿氯仿纯化纯化ph 5.7离心离心加入裂解液加入裂解液(trnzol-a+) 研磨研磨9. rna9. rna提取提取实验流程图实验流程图412 2 苯酚法苯酚法 细胞内大部分rna 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取rna时要把rna与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate, sds）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。9. rna9. rna提取提取421. 取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10ml sds-缓冲液使成匀浆，洗入 各eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1ml，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min2. 置冰浴中分层，在0-4低温环境下，10000r/