基因工程抗体课程设计

1、基因工程课程设计设计说明书基因工程抗体的研究起止日期： 2013 年 12 月 23 日 至 2014 年 1 月 5 日学生姓名*班级生物技术*班学号*成绩指导教师(签字)*学院2013年1月3日摘 要基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染到适当的受体细胞后所表达的抗体分子。基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体。本文扼要介绍基因工程抗体的进展情况及其分类、技术路线和临床应用。关键词：抗体；基因工程；重组ABSTRACTGenetic engineering antibody, anther named recombi

2、nation antibody, was an expressing molecule antibody which being assemble again after it processing and transforming from antibody genetic. Genetic engineering antibody was the third generation antibody at polyclonal antibody and monoclonal antibodys heels. The text main introduce developing about g

3、enetic engineering antibody and its sorts, technical route, clinical application.Key words: antibody; genetic engineering; recombination目 录一 研究背景4二 基因工程抗体的类型52.1完整抗体52.1.1嵌合抗体52.1.2 改型抗体52.2小分子抗体52.2.1 单链抗体62.2.2 双链抗体62.2.3 Fab 片段62.2.4单区抗体62.3多价抗体72.4抗体基因组文库7三 基因工程抗体的临床应用73.1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用73.2基因工程抗体

4、的抗感染作用83.3细胞内抗体83.4用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术9四 工程抗体的技术路线9五 小结10参考文献11一 研究背景基因工程抗体, 即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中, 在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR 分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子, 筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。借助于基因工程

5、技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造。抗体是“Y”字型的四肽链结构，由2 条相同的重链和2条相同的轻链借助二硫键连接而成。分析不同的免疫球蛋白的重链和轻链氨基酸序列时发现，在多肽链N 端, 占轻链的约1/2( 含107130个氨基酸残基) 或重链的约1/4( 含107130 个氨基酸残基) 的区域，氨基酸排列顺序随抗体特异性的不同而有所变化，称为可变区(V 区)，V 区中的高变区(HVR) 是抗体与抗原( 表位) 特异性结合的位置，因HVR 序列与抗原表位互补，故亦称互补决定区(CDR)。V 区中氨基酸组成和排列顺序变化小的部分为骨架区( FR)。V 区的3 个CDR 分别被4 个

6、FR( 14) 所隔开。多肽链的C 端，占轻链的1 /2 和重链的3 /4 的区域,其氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量均较稳定，故称为恒定区(C 区) 。基因工程抗体主要是相对这些区域进行改造所得到。抗体在生物医学领域中的应用极为广泛，其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3 个发展阶段。1975 年，Kohler 和Mlstein建立了体外细胞杂交融合的杂交瘤细胞，产生了仅针对某一特定抗原决定簇、纯度很高的单克隆抗体。由于单克隆抗体的高度特异性，使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断及其他领域得到广泛应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷，如完整抗体分子大，大部分抗体是鼠源

7、性抗体，应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA) 等，因而妨碍了其在临床上的应用。为了克服大分子单克隆抗体的缺点，人们利用基因工程技术制备了人鼠杂交和完全人源化的抗体，以生产更加有效的抗体诊断及治疗制剂，越来越多地被用于临床医学和临床研究，这类抗体被称为第三代抗体。天然的抗体分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键和其它的分子间作用力连接在一起的球状蛋白。早在20世纪50年代末期，Poter和 Nisonoff的研究成果结合电镜观察的结果，导致了经典的免疫球蛋白单体的Y型结构模式：两个臂为Fab 段，每一个Fab 段由一个轻链和部分的重链组成，Fc 段则包含剩下的重链。除了Fab，Fc

8、 段和F(ab)2段，免疫球蛋白分子单体还可以分成其它不同的片段，如Fd段为Fab段中的重链部分；VH为重链可变区片段；VL为轻链可变区片段；使用人工合成的短肽接头一般为(G4S) n将VH与VL头尾相连所组成的抗体片段被称为单链抗体(single chain antibody)，又称scFv。这些不同的片段对基因工程抗体的组建有重要意义。二 基因工程抗体的类型2.1完整抗体将鼠源性单克隆抗体经基因克隆及 DNA重组技术改造，将其相当部分氨基酸序列为人源序列所取代，以此来减少异源抗体的免疫原性，避免诱导产生人抗鼠抗体(human anti mouse antibody，HAMA) 和过敏反应，

9、从而利于体内诊断及治疗使用。目前研究较多的是嵌合抗体和改型抗体。2.1.1嵌合抗体将鼠单克隆抗体的可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后，插入表达质粒，最后在转染细胞表达所产生的嵌合抗体分子，称之为嵌合抗体(chimeric antibody) 。其中可变区具有结合抗原的功能，而恒定区则具有抗体效应功能、免疫原性和种属特异性，这对肿瘤的免疫治疗是非常重要的。嵌合抗体的 Fc 段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长抗体在血清中的半衰期。这种技术保留了完整的鼠单抗可变区序列，其亲和力和特异性都得到了保证，但也保留了鼠可变区的异源性，仍可能诱导产生 HAMA。目前已研制出了很多嵌合抗体，有些已进入期

10、临床阶段，主要用于恶性肿瘤的诊疗。2.1.2 改型抗体 为了降低嵌合抗体的免疫原性，以利其在临床上使用，在嵌合抗体的基础上又构建了改型抗体(reshaped antibdy，RAb)1。改型抗体是指利用基因工程技术，将人抗体可变区(V) 中互补性决定基(Complementarity determinative region，CDR)氨基酸序列改换成鼠源单抗 CDR 序列，重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb 亦叫“重构抗体”，因其主要涉及 CDR 的“移植”，又可称为“CDR 移植抗体(CDR grafting antibody)”。此种抗体可以使人单抗获得鼠单

11、抗的特异性并最大限度地减少鼠单抗的免疫原性。2.2小分子抗体小分子抗体是利用重组 DNA 技术，通过细菌表达决定抗体特异性的结构域所得到的，其大小只有完整IgG分子的 l/ 6l/ 2，小分子抗体有分子量小、穿透性强、免疫原性低，半衰期短，可在大肠杆菌等原核体系表达以及易于进行基因工程操作等优点。2.2.1 单链抗体单链抗体(Single chain antibody，scFv)是将重链可变区基因与轻链可变区基因用一寡聚核甘酸连接，在大肠杆菌中表达成一单链多肽，并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体，大小仅为完整 IgG的 l/ 6，与抗体分子相比，scFv 在药代动力学上

12、表现出了更好的组织穿透力，用于治疗时就可进入一般抗体不能达到的部位。同时由于抗原结合面不变，抗体片段拥有全部结合特异性。单链抗体的独特之处在于其多肽接头，多肽接头可设计为具有特殊功能的位点，如金属螯合、连接毒素或药物等，以用于影像和临床治疗。单链抗体其优越性在于可通过包含体大量表达、易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，是目前研究最多的小分子抗体。2.2.2 双链抗体通过化学或基因交叉连接 Fab和 scFv 片段将其改造为二聚体复合物，其中最成功的设计就是通过缩短单链抗体间的接头，使VHVL之间形成配对，形成的双链抗体也可以运用此方法将scFv改造为三聚、四聚抗体。这类抗体比单链抗体在

13、抗原特异性识别和结合方面性能更好，在免疫诊疗方面前景十分广阔。2.2.3 Fab 片段将重链 Fd 基因与完整的轻链基因 5端接上细菌的信号序列，所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可分泌到周质腔，信号肽被信号肽酶所裂解，生成的 Fd 段和轻链在周质腔中完成立体折叠和链内、链间二硫键，形成异二聚体，成为有功能的 Fab。这种小分子抗体具有抗体的活性，而大小为完整 IgG的 l/ 3。另外，因其不含有 Fc 段、分子量小、免疫原性低，故其在肿瘤治疗上具有很大的有优越性。2.2.4单区抗体根据抗体分子的结构，一般将 Fv 称作抗体的最小单位，但有些更小的亚单位仍具有结合抗原的能力。如单独重链可变区仍可

14、保留与抗原结合的能力，而且保持了完整抗体的特异性，称之为单区抗体(Single domain antibody)，它的亲和力低于完整的 Fv。单区抗体大小只有完整 IgG分子的 1/12 ，所以单区抗体较完整抗体更容易穿入细胞，可以到达完整抗体不能接近的部位。根据它的这些特性，单区抗体有望作为具有抗原特异性的基本单位，用来构建有效应功能和结合亲合性的抗体。2.3多价抗体 传统的抗体只能结合单一特异性的抗原分子，而多价抗体的多个抗原结合位点具有不同的特异性，能结合不同的抗原分子。研究较为深入的是双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb) 。此类抗体是将两个不同的结合特异性片

15、段融合在一起形成的，能分别与靶细胞和效应细胞结合靶向杀灭肿瘤细胞。BsAb 的研制经历了鼠源性单克隆抗体的化学偶联、双杂交瘤和基因工程 BsAb 三个发展阶段，其中基因工程 BsAb 的类型较多，它们与鼠源性 BsAb 相比具有较低的免疫原性和较好的组织穿透力，有的已在产量和纯度方面达到了临床应用标准。2.4抗体基因组文库 抗体库是近些年出现的一门新技术，抗体库技术是指用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因。1989 年，美国 Scripps研究所 Huse 等首次报道了抗体组合库的构建，其

16、基本技术过程为 :采用 RT2PCR 技术获得抗体基因，构建抗体库，对库进行筛选，并在适当载体上表达。抗体库技术省去了细胞融合步骤，省时省力；扩大了筛选容量，可在原核系统中表达，生长迅速，成本低 ;因直接克隆到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体；从根本上改变了单抗的制备流程，在生物技术研究及开发中，成为众所瞩目的热点之一。目前，我国已建成迄今为止世界上第 1 个针对 SARS 的基因工程抗体库。噬菌体抗体库技术是抗体库领域的最重要进展，它的出现，推动了抗体基因组文库的发展。除此之外，还有 mRNA蛋白质复合物库、细胞表面库、转基因鼠等技术方法，这些都大大丰富了抗体库技术。三 基因工程抗体

17、的临床应用近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，并在医学领域的许多方面都极具应用潜力，如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。3.1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用 放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估。以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，由于基因工程抗体如单链抗体、Fab 片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强，所以更适于放射免疫显像。例如，中等大小的双特异性抗体(60KD) 与半衰期较短的同位素相连，由于清除率快被用于临床影像

18、学。治疗用的放射性标记抗体如小抗体(90KD)，和半衰期较长的同位素相连，可在肿瘤部位达到较高浓度，适合用于肿瘤治疗。2002 年，美国 FDA批准了第一株用于肿瘤免疫治疗的放射性标记抗体 (Zevalin)上市2。恶性肿瘤的导向治疗，是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能。这些分子包括 :放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒。对肿瘤治疗来说，设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞。此外，抗体还可与携带药物的脂质体、各种 PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学3。作为

19、免疫脂质体，转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑4。抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗5。3.2基因工程抗体的抗感染作用 预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素，但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如 SARS、AIDS等，抗体治疗可做为首选方案。如在治疗 AIDS方面，利用抗体工程技术已成功地制备出 HIV病毒整合菌的单链抗体 ScAb2219，对 HIV 病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为 AIDS 基因治疗的有效手段。呼吸道合胞病毒(RSV)易引起婴儿呼吸道疾病，如细支气管炎和肺炎，并可引起严重的并发症，目前已有人源化单克隆抗体 Paliv

20、izumab 经美国 FDA 批准上市，临床实验证明无毒、副反应，并可显著降低婴儿的住院率6。我国率先建立了针对 SARS的基因工程抗体库，这对于 SARS的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。对于中和其它病原分子，FDA已批准 Fab 单体分子作为抗蛇毒药物 ;scFv 片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。3.3细胞内抗体 随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展，诞生了细胞内抗体技术。这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器，与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体，最典型的是scFv，被称为内抗体。胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是

21、HIV21 复制、肿瘤基因治疗方面，现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。体外培养来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗，往往会引起排斥反应，而 MHC类分子是引起移植排斥的重要抗原。Mhashikar 等用编码抗 MHC单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞，结果显示明显降低了 MHC的表达，细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。3.4用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术 生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术。对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性和高特异性。从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界

22、面，用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展7。随着体外机械人的出现，这一技术将进一步发展，并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。四 工程抗体的技术路线从杂交瘤细胞中提取总RNART-PCR获得轻链可变区基因片段RT-PCR获得重链可变区基因片段构建轻链基因的表达载体构建重链基因的表达载体筛选阳性克隆转染细菌挑选双重转染子制成原生质体转染哺乳类细胞嵌合抗体的表达五 小结抗体技术已深入到生物学和医学的许多领域，并成为一项必不可少的工具，具有非常重要的理论研究价值和实用价值。目前，该技术不仅可用于戒毒、血液性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官移植、肿瘤、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊疗，而

23、且在蛋白质纯化工程中也有广阔的应用前景。 参考文献1 Ishida T, Tmai K. The expression technology of chimeric and humanized antibodies J. Nippon Rinsho, 2002,60 (3):439-444.2 Wiseman GA , Leigh B , Erwin WD , et al. Radiation dosimetry results for Zevalin radioimmunotherapy of rituximab-refractory non-Hodgkin lymphoma J. Cancer,2002 ,94(2) :1349-1357.3 Kreitman RJ. Toxin2labeled monoclonal antibodiesJ. Curr