一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用

1、一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用Peter B. Jacquemin*，Rodney A. Herring1(University of Victoria, Department of Mechanical Engineering, 3800 Finnerty Road, BC, Canada V8P 5C2）摘要：激光全息共聚焦扫描（CSLH）显微镜是利用一束聚焦激光束测量流体温度在三维空间的分布情况。激光束通过样品并被参考光束干涉形成全息图。折射率的变化将引起全息图边缘移位。边缘移位取决于材料的温度、压力或者成分。层析重建算法是为了显微镜而派生出的基于光束的数值孔

2、径的算法。窄视角扫描受限于激光探测样品的数值孔径和锥角大小，这些因素会增加样品三维数据的误差。显微镜的全息术摄影保留了全息图中基于ak/10波边缘的0.1C敏感温度下对象的相位。通过实验数据得到在三维重建中的温度分辨率在1C。激光全息概念和层析重建全息图数据的方法可以被应用于测量精密的位移、温度、压力以及构成激光波长附近位置的分辨率。微流体和其他领域的研究和应用技术将会考虑到激光全息共聚焦扫描的这种独特的测量特点。关键词：共聚焦；显微镜；全息图；激光；三维重构1.介绍赫林1在1997年首次公开发布了结合共聚焦显微镜和全息术概念得到的一个3D显微镜图像。相比只对振幅和光强度敏感的光学显微镜而言，

3、全息显微镜可以记录下研究对象的振幅和相位甚至于光线的全部信息。标准光学显微镜下的样本会吸收光谱能量，这会忽视相位性能和对折射率的敏感程度。激光全息共聚焦扫描显微镜的全息图是利用激光传输通过标本产生的折射率累积效应的测量方式。相移是全息图边缘移位表现出的，全息图的边缘移位是由于折射率的改变的。折射率是由介质或者样本中的光波长以及透过样本的广成长度决定的。激光全息共聚焦扫描显微镜的公交特点降低了图像的像差，同时利用迪克逊2等人研发的特殊光学几何结构提高三维扫描图像的分辨率。激光全息共聚焦扫描显微镜的全息技术提供了一种利用相位测量样品折射率的方法。样品的相位通过折射率值的推算就可以推导出基于光学特性

4、的流体的温度。激光焦点在样品中的点扩散函数为170lm，这是通过Zemax光学系统的设计软件和实验测量出的。当扫描的计算网格增加625lm/步，在三维环境下（立体像素大小），每625lm的计算网格内都能产生独立的分辨率。然后再结合多组扫描全息图就可以重建样品的三维折射率。利用激光与样品相互作用的测量结果表现为传感器或全息图中的厚度累积效应。通过样本长度的累计折射率通常被称为层析重建中的氡线积分。侯赛因和沙克赫尔3在这个试验中已经利用激光扫描到了样本中的三维图形。侯赛因和沙克赫尔3解释了相位解缠但只能得到透过样本厚度的平均温度。Tieng和Chen4应用了一种改进后的联立代数方程重建技术对空气流

5、动进行三维重建，但是基于几何构型的敏感性存在误差。激光全息共聚焦扫描显微镜限制了激光探针探测样本时的扫描角度的数值孔径，这样会导致重建矩阵和矩阵的奇异性出现差错。激光全息共聚焦扫描显微镜的挑战在于在一个受限制的扫描视角中产生较低的重建误差。高分辨率的全息图是利用8184像素的CCD线扫描相机记录下的。激光全息共聚焦扫描显微镜的一个独特的特性是样品的完整3D折射率可以从没有任何旋转扫描的单一视角或者观测窗口中得到。扫描光束穿过样品只采用探针重建的数值孔径。3D成像的两个要求即是激光全息共聚焦扫描显微镜成像的需求。样品相对于射线必须是透明的，同时扫描探针必须是一个汇聚光束而不是一个平面光。不同之处

6、在于汇聚光束透过样品作为焦点的是扫描沿着光束的传播轴，而平面光不能区分透过样品路径的任何焦点。每一次扫描都会给出全息图测量的累计厚度折射率。这需要一个由雅克曼和赫林5,6提出的名为“威利”的独特的重构方法，从而将厚度扫描全息图转化为3D模式。3D模式指出了样品某一点的相位和强度。“威利”算法利用所有的相位测量和已知的边界条件计算样品每一点的折射率。另一种基于断层扫描三维重建的方法也是为激光全息共聚焦扫描显微镜而开发，这种方法是为了显示样品的几何信息从而被莱7等人提出。“威利”算法的优点在于不需要提前验证样品信息。共聚焦光学扫描全息术的更详尽的研究由雅克曼8,9等人实施。一种简单的生成全息图的方

7、法如图1所示，将物体光束和参考光束并排连接，构成的夹角使得重叠的部分和其他部分在相机中生成全息图。这种光学布局需要在扫描时移动样品，同时激光全息共聚焦扫描显微镜利用电流计光束控制反射镜从外侧转化为样品的激光探针焦点。图1参考光束与物光束在图像平面叠加形成全息图1.1.与其他全息显微镜的相似和异同激光全息共聚焦扫描显微镜是类似于相位成像显微镜，它对透明样本的相移很敏感，这通常是由于温度梯度变化或者是成分变化引起的。一种特殊的区别是温度的测量是通过光线传播的轴向还是样本的深度。对于层析重建，通过限制视角改变数值孔径或者光纤锥角将产生奇异矩阵或者过度重建误差，这是由于重建矩阵的缺陷引起的。共聚焦显微

8、镜通常采用针孔透过一个狭窄的荧光样品的光谱带。散焦射线受阻将减弱聚焦深度。共聚焦显微镜逐点扫描样品，并且通过样品深度的多平面叠加重构一个图形。多平面叠加后的合成图像接近无限的景深。区别在于激光全息共聚焦扫描显微镜使用共焦光学减少了对全息图的光学畸变以及扫描镜倾斜式与参考光束产生的偏离轴线误差。锥角三维重建方法需要至少160°的扫描角度，激光全息共聚焦扫描的锥角扫描时使用二十八条探测光束。充电误差是通过包括沿着侧壁的边界温度条件建立，这种方法用于显微镜的特点。描绘几何体，利用在整个样本上分布的边缘射线束以及边界条件的稀疏成都来进行重建矩阵的反演和三维重建。1.2.限制和性能激光全息共聚

9、焦扫描显微镜可以通过阻断参考光束从而很容易地被成像显微镜控制，这对于检测不透明生物样本很有好处，同时可以提供全息模式中透明区域结构的敏感性。激光全息共聚焦扫描显微镜类似于数字全息显微镜或者相位成像显微镜，但是它不能生成一个图像，而是将全息图转换为温度或者是温度的组合图。探针光束的数值孔径可以相对地提高重建的精确度，这将在样本上产生更大尺寸的焦斑同时减少光学分辨率。一种折衷于高光学分辨率和低重建误差的设计达到了0.32的数值孔径以及一个模糊光斑直径为220lm的探测光束。位置分辨率采用光束控制镜是0.1mat和625lm的扫描步距。一个k/20波的可溶解的边缘变化可以引起的温度误差是0.02&#

10、176;C，这代表了样品试管5毫米深度时的平均温度变化。温度稳定性由电池中的加热器的功率、三重绝缘热电偶的冷节点决定，全息图的稳定性由高压电流阻尼的光学仪器的主动隔振控制。相移的限制在相位扫描中不能超过一个波长，否则波长或者周期的数值是不确定的，相位解缠也是不能实现的。这限制了槽内温度6度以内的变化。添加一个不同波长的激光可以将温度区间扩大到50摄氏度，同时由于相位解缠能力会保持稳定的温度分辨率。2.激光全息共聚焦扫描显微镜的设计和实验步骤激光全息共聚焦扫描显微镜采用光束转向镜和转化模块扫描一个如图2所示的固定液态样品。激光全息共聚焦扫描光学设计的一个关键环节是在扫描时，针孔光阑在共焦光学截面

11、要保持静止。共焦光学减少了光学像差，比如彗形象差和虚拟光圈，这在样品中都是重要的光学共轭焦点。在扫描期间，全息图的光学畸变减少是因为只有样本射线透过焦点和针孔光阑才能产生全息图。激光全息共聚焦扫描显微镜的光学设计如图2所示，示意图展示了一束直径可从35nm扩展到456nm的蓝色激光，然后波阵面被分为两个间距为6mm的D形波束。光线进入到光束转向镜(BSM)部分，得到了样本中由间隙提供的±2.5mm的x轴和y轴扫描结果。光线从BSM部分传出进入到一个光学循环，它在样本放置处包含一个远心镜头。一个在光学循环中继透镜中的潜望镜改变了光线的传播方向，并且在立方分束器上建立了一个光平面。图2

12、CLSH显微镜的光学设计通过待测样本的光束为物光束，绕过待测样本的光束是参考光束。参考光束透过液体样本，恒定的折射率产生了相同的焦点，物体光束也将再准直。全息图将显示每一个扫描位置，除了激光全息共聚焦扫描显微镜产生的光学相移没有光路穿过的位置。这些光学畸变对测量产生的影响，将会记录在全息图的每一个扫描位置上。然后采用流体样本测量来消去光学影响。图3 CSLH显微镜的内部结构远心镜头系统安装在传输轨道上，并且沿着光学传播轴向即Z轴扫描方向。这个装置为扫描提供了一个固定的样本，这样可以明显的减轻震动。降低样本的震动干扰对于敏感性的科学研究是非常重要的，比如这些干扰会产生微重力的影响。液态样本中的聚

13、焦光束被设定为f/4焦比或者28度的收敛角，这样可以降低重建误差（见第4节）。光线在同一立方分光镜出离开光学回路，它们进入并方向传播到BSM部分。随后光线被分离到共聚焦光学部分，它们通过一个共焦双针孔焦点到达液体样品的物体光束位置。双针孔孔径定义了一个共轭光学配置样本内的焦点，消除了过度的球面像差以及光束扩展器、BSM部分、光学循环不愤和潜望镜头产生的彗形像差。然后光线通过另一个远心镜头进行二次瞄准，然后射入到双光楔或菲涅耳双棱镜。被光楔或双棱镜偏转后的光束干涉到CCD相机。通过BSM部分的你想光束传播提供了样品光束的固定焦点，同时参考光束在扫描时进入到双针孔孔径中。进一步的细节雅克曼5在其他

14、光学研究中提出。图3显示了一个安装在光学平台上的激光全息共聚焦扫描显微镜。图示免回的是一个用于这些实验的457nm的蓝色激光，一个658nm的红色激光（没有在这些实验中用到）以及一些光学组件如反射镜、镜头。光学棱镜和千分尺。这种显微镜包含一个新港XPS-C8运动控制器、新港气动隔震以及剑桥工艺的BSMs电流计。传输段有一个0.1lm的位置分辨率，并且被一个虚拟仪器程序控制。图4中显示的是一个包含均BK7玻璃溶液的试管在底部3毫米以上的部位加热。试管底部的加热器给液体样品提供了一种基于径向扩散的温度梯度。用一根热电偶探针测量边缘温度和内部温度实现整个计算网格的重建方法。图4 热电偶与底部加热器抛

15、光石英玻璃是一个内部规格为5×5×45立方毫米的透明容器。它被装满了Carg实验室与BK7液体电池相匹配的硅油。硅油的折射率是一个和波长与温度相关的函数，它的折射率在波长为457nm以及温度为25摄氏度的条件下为1.4670。和波长相关的折射率是由柯西方程得到，并由Cargille实验室BK7规格的匹配液提供。折射率(n)转换为温度(T)是基于折射率硅油的特性，有以下方程给出： (1)温度的范围在15到35摄氏度。温度范围被控制在小于7摄氏度是为了在测量液体样本点时避免相移大于单个边缘的间距。温度范围大于7摄氏度时需要进行相位解缠。高浓度的硅油减小了对流电流并且提供了加热时

16、所需的导热方式。稳态热传导条件提供了光栅扫描测量显微镜的特点。探针的大小和热电偶可以降低任何对流电流和低温散热器的影响。图 5扫描和重建时的坐标系和计算平面如图5所示，沿Y轴的垂直切片提供了三维重建的第三条轴。第一条轴沿着激光传播滤镜或Z轴进入到液体电池中，第二条轴在水平面沿着X轴在也电池的边界极点处传播。垂直切片或水平面沿着Z轴被扫描，如图6所示。光束的扫描焦点在8个恒定的x(i-1)较低的位置，其他的8个焦点在恒定的x(i+1)的较高的位置。通过锥面光束的边缘光线产生的干涉条纹图样被用于重建算法中。这两束边缘光线与扫描位置结合在水平面或者垂直面产生了2(8+8)=32的相移。边界温度条件是

17、沿着液体电池侧壁所得到的X轴的最大值和最小值。加热器的垂直距离是与高度坐标系相关，如表1表示在恒定的垂直面上有一个0.6mm的距离。折射率分布图转换到温度分布，是由四个垂直平面决定的。在垂直平面为0.5、1.1、1.7和2.8mm处增加加热器。基于热电偶测量的折射率与全息图重建得到的折射率进行的比较。表2显示了全部在有加热器的垂直平面上的的重建折射率误差和温度误差，这些误差是通过每一个竖直平面上超过12组测量值求平均值得到的。更详细的误差分析在在雅克曼5中提出。图6在CCD摄像机中物体光束与参考光束在干涉后完全重叠。完全重合的光束与两束边缘光束排列，从而将重建误差最小化。边际射线位于28锥束的

18、边缘。Zemax仿真全息图产生的照相机中的平面图形如图7所示，边际射线实在极端的顶部或者底部。锥角定义了射线边缘镀金的边际射线束，比起中央的射线束，这里有更多的网格单元被拦截。边际射线束停工了更多的重建信息，这可以减少沿深度或者z轴的重建误差。中央射线束产生相同的相移信息，其对象是不希望得到的光线沿轴深度传播产生的重建。图7中的水平边缘间距是基于波束收敛角和激光的波长得到的。条纹间距产生的请问变化率曲线代表了透镜的球面像差以及偏离轴线光线重叠而产生的彗形像差。一台像素为18192，像素分辨率为7lm/像素的线扫描CCD相机Dalsa Piranha被用于此实验。高分辨率线扫描相机能够检测到边缘

19、光线的条纹。如图8所示，从相机测量到的边缘数据在全息图中的一条边缘光线中显示，这里相移至关重要的作用是减少重建误差。峰值振幅的变化主要是由于微观光学表面的灰尘引起的。图 73.重建和性能重建32折射率值在电光源的单一水平面上是基于16测量边界条件和超过16扫描位置的32测量边界条件。一共有48个测量值，这需要重建一个单独的折射率分布图。折射率误差之间的区别是来自于热电偶测量全息图的温度重建。重建的温度误差(1-RMS)超过了32折射率值的公式如下： (2)激光全息共聚焦扫描显微镜的性能评估是通过比较重建温度后探针热电偶的温度来实现。热电偶的温度分辨率在±0.05°C，激光全

20、息共聚焦扫描显微镜的温度分辨率的单一度量值为±0.07°C RMS。一个包含32个温度采样点的水平面的重建误差为1.3°C RMS。热电偶被用来测量边界条件和重建零位误差。主要的误差来源是在仿真建模研究中忽略了侧吸重建算法的误差。图 8图 94.结论和讨论相移灵敏度到温度的改变如图9所示，温度为0.6摄氏度的改变可以引起0.8个波长的相移。激光全息共聚焦扫描显微镜的相移灵敏度与温度的斜率图如图7所示，利用虽小而惩罚即可算出立体升温率为1.4波长/摄氏度。根据测量数据可以求出相移均方差误差为0.010个波长。 (3)在全息图中基于可溶解相移的单一相移测量温度为0.0

21、07°C，这主要是温度的敏感性对折射率的影响而产生的。扫描全息图实际上就是三维折射率的相移重建测量。图 10热电偶是一种铜-康铜的MT-2/5的有29种规格(0.33mm)的直径和50mm的长度的皮下注射器。它有一个25.94摄氏度/10mV的灵敏度和10ms的热响应时常。一个低噪声高增益的放大器可以提供±0.05摄氏度的灵敏度。热电偶时连接在低噪声放大器的三阶低通滤波器。低通滤波器输出到一个数据采集板上。虚拟仪器数据处理模块提供了五分钟内每秒更新一次的稳定采样时常和采样频率。热电偶冷段三重绝缘，加热后在20摄氏度的高温环境中的输出在五分钟内没有发生改变。热电偶的校准是使用

22、冷水和热水，利用水银温度计作为参考而不是通过T型热电偶查找敏感度表。探针热电偶提供了在加热液体中的温度测量方式，如图10所示。图 11温度曲线是在加热器0.5mm以上恒定的沿着x、y轴恒定水平面，或者y=1.8mm的高度。当热电偶测量完后被撤掉，然后激光通过液体电池时液体温度梯度稳定在2分钟。用激光测量的时间比10秒还少，这要归功于X轴上的机械扫描电流计和Z轴上的传输部分。温度曲线转化为折射率曲线采用的是Cargille实验室的折射率匹配液，如图11所示。图 12图 13折射率的重建曲线如图12，稳定在海拔1.8mm或者加热器以上0.5mm的间隙。测量高斯曲线要通过测量流体的热传递得到。增加加

23、热器的镜像距离可以减少温度的峰值和曲线的平缓度。折射率的重建曲线如图13，在海拔0mm处或者加热器以上2.3mm处是恒定的。测量误差的主要误差源是由边界条件引入的，误差可以作为层析重建算法减少到可以忽略的标准。这是我们所知的第一次通过单一视图端口的观测串口利用相移全息图产生的折射率和内部温度的三维图像。重建的三维温度由穿过液体样本四条轴线的温度曲线表示。沿着Z轴的重建误差最大，这是由于扫描角限制引起的。测量的温度随探测距离的增加而降低，高斯曲线如预期的效果随温度的变化径向展开。激光全息共聚焦扫描显微镜安装了一个非入侵测量的单一角度观测窗口。4.1.应用激光全息共聚焦扫描显微镜有许多应用，如测量

24、马朗格尼流体对流和热传导的影响在空间微重力环境中的运动和激光振动。激光全息共聚焦扫描显微镜设计的优点是液态电池被严格地固定在光学扫描中的xyz轴上。其他应用在生物样本中的微流体和透明区域的相位成像，这种方法可以利用独特的派生出的“威利”重建算法。精确的三维重建给定了一个有限的视角和不准确的重建矩阵，但可以从一个观测点或固定的观察窗进行观测。激光全息共聚焦扫描光学显微镜可以很容易通过改变一些光学组件实现从传播模式转换到反射模式的操作。例如，基于激光全息共聚焦扫描“威利”算法的重建原则应该应用于超声医学影像的成像中，这一应用是由赫林10和费来尔11等人提出。5.概要和总结激光全息共聚焦扫描显微镜是

25、一项独特的设计，结合了公交显微镜与全息术的特点。激光全息共聚焦扫描显微镜已经验证通过了测量硅油的三维折射率到温度三维图的转化。激光全息共聚焦扫描显微镜用汇聚激光探针测得每一个扫描点的全息图。样品的三维温度图第一次从单一的视角窗口得到。热电偶的测量敏感度和误差是基于高于光源加热器的四个恒定海拔平面上的三维温度重建。显微镜可以用于测量一个透明固体、液体或者立体提如火焰的温度。激光全息共聚焦扫描显微镜从扫描全息图到阶梯温度的转化可以得到一个三维数组。三维重建主要是利用扫描探测光束的聚焦点、边界条件以及“威利”矩阵重建算法。重建不需要旋转扫描机制就可以完成。用于重建的一个单独的观测窗口可以由一个聚焦探

26、针的锥角表现。为激光全息共聚焦扫描显微镜派生的的重建方法为有限制的观测角度有所帮助。致谢感谢加拿大金融创新基金会(CFI), 加拿大自然科学与工程研究委员会 (NSERC)和维多利亚大学。参考文献1 R.A. Herring, Confocal Scanning Laser Holography and an associated microscope: a proposal, Optik 105 (2) (1997) 6568.2 A.E. Dixon, S. Damaskinos, M.R. Atkinson, A scanning confocal microscope for tran

27、smission and reflection imaging, Nature 351 (1991) 551553.3 M. Hossain, C. Shakher, Temperature measurement in laminar free convective flow using digital holography, Appl. Optics 48 (10) (2009) 18691877.4 S. Tieng, H. Chen, Holographic tomography by SART and its application to reconstruction of 3D t

28、emperature distribution, Heat Mass Transfer 26 (1) (1991) 4956.5 P.B. Jacquemin, A Confocal Scanning Laser Holography (CSLH) Microscope to Non-Intrusively Measure the Three-Dimensional Temperature and Composition of a Fluid, PhD Thesis, University of Victoria, Victoria, B.C. Canada, 2010. 6 P.B. Jac

29、quemin, R.A. Herring, A low error reconstruction method for confocal holography using limited view tomography to determine 3-dimensional properties, Microsc. Microanal. 16 (2) (2010) 288289.7 S. Lai, R.A. McLeod, P.B. Jacquemin, S. Atalick, R.A. Herring, An algorithm for 3-D refractive index measurement in holographic confocal microscopy, Ultramicrosco