细胞内铜离子浓度的调控(修改版、刘漫)

1、 细胞内铜离子浓度调控 细胞内铜离子作用对生命而言, 铜是一种必须的微量元素, 它以辅基的形式参与细胞内多种重要的代谢途径。 1）赖氨酸氧化酶参与结缔组织的形成和胶原交联 2）超氧化物歧化酶清除胞内自由基 3）细胞色素氧化酶是呼吸链电子传送蛋白 4）酪氨酸酶参与色素形成途径 5）多巴胺羟化酶则与神经传导细胞内铜离子浓度过低会影响这些酶的活性及相应的生理代谢途径, 影响细胞的生存。但细胞内铜离子浓度超过生理需求也会引起严重的问题。人体铜离子代谢示意图细胞内铜离子浓度控制虽然细胞内总的铜离子浓度很高，通常在10-5一10-4mol/L范围内，但是游离铜离子浓度通常小于10-18mol/L，即一个细

2、胞内只含一个游离铜离子。生理性铜离子浓度的维持主要在于四个环节: 铜离子进入胞内(uptake) 胞内运送(translocation) 合成金属蛋白(synthesis) 清除过多铜离子(elimination)。对于过高或过低的铜离子浓度, 细胞主要是通过改变流入量(influx)和流出量(efflux)来应答。另外, 金属硫蛋白可与过多铜离子结合,避免其破坏作用, 这种保护方式叫隔离(sequestration)。细胞内铜离子浓度的传递过程铜离子的摄取(uptake) 细胞膜上的转运蛋白只对Cu+具有识别特异性，所以Cu2+不能被直接跨膜转运，必须在质膜上FRE1/2(Fe3+/Cu2+

3、还原酶：Ferric ion Reductase Enzyme)还原成Cu+后进入细胞。CuCu2+2+CuCu+ +FeFe3+3+/Cu/Cu2+2+还原酶还原酶铜离子的摄取(uptake) 1 1）高亲和力转运体）高亲和力转运体系系(High(High一一affinity affinity systems)systems) Cu+被跨膜蛋白一一CTR(copper transporter protein)转运，该蛋白由ctr基因编码，具有铜离子高亲和性和特异性，转运过程消耗能量。Cu+经ctr的转运依赖Cu+一2K+对向运输机制，即每转运一个Cu+，需要运出两个K+。CTR1/3Cu+2

4、K+Cu+2K+CTR基因1、ctr1(Copper transporter1) ctr1基因首先在酵母转运铁离子体系缺陷型菌株中被发现。ctr1基因的表达受细胞内Cu+有效浓度的影响，高浓度Cu+抑制ctr1基因的表达，低浓度促进ctr1的表达。ctr1是一个三次跨膜的蛋白质，含有406个氨基酸，N端的128个氨基酸富含甲硫氨酸、丝氨酸、组氨酸残基，可以结合多个铜离子，还含有3个19个氨基酸长度的重复序列和n个M一X一X一M(X指任意氨基酸)基序(motif)的重复序列，但其具体作用不详，可能与转运有关。N端位于细胞膜外，可能用于清除未被摄取的Cu+。CTR1以多聚复合物(multimeri

5、ccoplexes)的形式发挥功能。CTR基因ctr1基因高浓度Cu+低浓度Cu+ctr1蛋白质ctr1基因ctr1蛋白质抑制促进表达表达结合多个铜离子结合多个铜离子Cu+浓度Cu+浓度CTR基因2、ctr3(Copper transporter3)ctr3是一个三次跨膜的蛋白质，含有241个氨基酸，与ctr1的序列有较高的相似性。ctr3分布在细胞膜和细胞器膜上，与ctr1是两个独立的铜离子转运体系，但在某些特殊的情况下如细胞内Cu+浓度极低时，它们可以协同作用共同转运以提高细胞内可利用的Cu+浓度。3、其他基因ctr1、ctr3都是在酵母菌内发现的，后来在植物和动物的CDNA文库内也发现具

6、有类似序列的Cu+转运蛋白，如拟南芥的COPT1（Copper transporte1)和人类Hela细胞的hctr1(Human conpper transporter1)。其中COPT1与CTR1蛋白的核昔酸序列相似性是49%。COPT1含169个氨基酸，hctr1含190个氨基酸，都具有类似ctr1的三个跨膜区，N端富含甲硫氨酸和丝氨酸。大鼠和小鼠体内也有类似的蛋白质序列，它们可能是负责Cu+转运的蛋白质家族。2、低亲和力的铜离子转运体系 酵母cDNA文库中的ctr2(Copper transporter2)蛋白与拟南芥的COPT1具有 相似的序列，可能是低亲和力的铜离子转运体系的成员。

7、ctr2含有三个跨膜区，与ctr1/ctr3不同的是其N端组氨酸、甲硫氨酸的含量低，因此不能结合大量的Cu+。在代谢过程中，ctr2对Cu+转运贡献不大，但它的存在却有利于Cu在细胞内的积累或区室化，同时可以使细胞对Cu的超载(overload)和毒性更敏感，ctr2基因突变的菌株对毒性有高抗性。铜离子的摄取(uptake)胞内运送(translocation) Cu+进入细胞以后，迅速与细胞内的铜离子结合蛋白如ATX1(anti-oxidant1)、COX17(Cytochrome oxidase17copper chaperone)等蛋白质相结合，传递到细胞质内的靶蛋白如SOD、 CCC2

8、(Copper chaperone for ceruloplasmin-like oxidase2)。象ATX1、COX17等细胞质内可溶性蛋白质叫分子伴侣(Chaperones)，参与细胞内的Cu+转运。现在发现细胞内由分子伴侣介导的Cu+转运方式主要有三种: 1)ATX1、HAH1与CCC2 2)COX17、hCOX17与SCO1 3)LYS7、CCS与SOD1)ATX1、HAH1与CCC2 ATX1存在于酵母细胞内，含73个氨基酸，一个MTCXXC的基序可以结合Cu+。在结合Cu+前后，ATX1表面的半肤氨酸含量变化很大，蛋白质构象的变化可能更加有利于Cu+的结合和释放。ATX1将Cu+

9、传递给CCC2，进而传递给铁离子摄入系统(Ironuptakesystems)如FET3/FET5(Fe transporter3/5)，参与铁离子的转运，并影响胚胎神经细胞内铜离子鳌合蛋白质数据库的构建及数据分析系统的分化和发育。 CCC2是P型ATPase家族成员(P-type ATPase)，定位于高尔基体上，N端有MTCXXC基序，两个半肤氨酸非常保守，可能与Cu+的结合有关。人类Menkes(MNK)和Wiison(wD)疾病蛋白与CCC2同源，N端有该基序的六个拷贝，MNK参与人类肝细胞中Cu+的传递，WD负责其它组织如肠粘膜的Cu+输出。ATX1传递Cu+的可能机理:ATX1的两

10、个半肤氨酸疏基结合细胞质内区域化的Cu+，然后与脱辅基的CCC2(apo一CCC2)作用，ATP水解供能，形成一系列含有ATXI一Cu一CCCZ的中间物，最后形成脱辅基的ATX1(apo-ATx1)和携带Cu+的CCC2。随后ATP水解，CCC2一Cu+构象改变，Cu+被释放入囊泡，插入靶蛋白FET3/FET5内。ATX1的65位赖氨酸是其活性位点，在Cu+捕获和释放中起重要作用。在该反应中，ATX1可能作为一种酶，降低Cu+在蛋白质之间转运的动力能障，使反应更易进行。 FET3/FET5是一次跨细胞器膜的转铁蛋白，属于多铜氧化酶家族(multicopper oxidases)成员，与Cu+具

11、有高亲和性，氧化区位于细胞器膜外。底物是O2和Fe2+，4个Fe2+被氧化成4个Fe3+，4个电子传给O2，形成H2O。 人类与ATX1同源的蛋白质是HAH1(Human anti一oxidant 1 homologue1)，二者氨基酸序列的相似性为47%。HAH1是稳定的单链蛋白质，含有68个氨基酸，形成2个螺旋和2个折叠，一个MXCXXC的金属离子结合序列。HAH1存在于细胞质和细胞核内，分布和稳定性不受细胞内的Cu+浓度的影响。两个HAH1单体与铜离子形成的HAH1同源二聚体发挥其功能。HAH1利用ATP水解提供的能量，与其它蛋白质相互作用将Cu+传递给类似CCCZ的P型ATPase家族

12、成员，如位于高尔基体成熟面的WD和MNK蛋白。虽然HAH1与ATX1本身无抗氧化特性，但它们可以将Cu+传给具有抗氧化作用的蛋白质来实现其抗氧化作用。1)ATX1、HAH1与CCC2ATX1Cu-ATX1构象变化Cu-CCC2铁离子摄入系统（FET3/FET5）铁的运输响胚胎神经细胞内铜离子鳌合蛋白质 COX17是一个细胞质内的可溶性蛋白质，分子量8KD，含有69个氨基酸，7个半胱氨酸，其中6个在进化中十分保守，3个功能必需残基包含在CCXC基序中。C端有线粒体的靶序列，使COX17暂时停泊在线粒体上，便于Cu+进入线粒体的膜间隙，进而经SCO1(synthesis of cytochrome

13、 c oxidase1)传给细胞色素c氧化酶。另外，细胞外高浓度的Cu+也可以通过被动扩散进入线粒体，以弥补COX17基因突变造成的线粒体内Cu+浓度的降低。COX17不稳定，易被降解。2)COX17、hCOX17与SCO1SCO1是线粒体膜上的蛋白质，CXXXC序列与Cu+结合，并将其传给细胞色素c氧化酶。细胞色素c氧化酶是位于呼吸链末端的复合物，由核基因和线粒体基因共同编码，2个血红素A和3个铜离子可以传递电子。scol基因的突变导致细胞色素c氧化酶失活，高浓度的Cu+不能使之恢复活性，这说明细胞色素c氧化酶不能直接络合细胞内游离的Cu+，只能依靠分子伴侣递呈Cu+。所以SCO1是一个激活

14、细胞色素c氧化酶的必需分子。2)COX17、hCOX17与SCO1COX17Cu+Cu-SCO1细胞色素c氧化酶激活 LYS7(Lysine biosynthesis7)存在于酵母细胞内，含249个氨基酸，有MTCXXC的Cu+结合区，它可将Cu+传给SOD。Cu，Zn-SOD单体含151个氨基酸，两个单体组成的同源二聚体作为细胞内的功能形式可以络合两个铜离子，两个锌离子。它能有效地清除活性氧，保护线粒体DNA免受氧化伤害，是体内主要的抗氧化酶类，SOD基因的缺失可以导致成人神经退行性疾病一一ALS(Amyotrophic lateral sclerosis)3)LYS7、CCS与SOD LY

15、S7Cu+ LYS7Cu+2（Cu，Zn-SOD）清除活性氧，保护线粒体DNA免受氧化 人类与LYS7同源的分子伴侣是CCS(copper chaperone for SOD)，它以同源二聚体形式特异地将Cu+传递给SOD。CCS的单体共有三个结构域(domains):N端结构域(Domain ），含有一个MTCXXC的金属结合基序，与AIX1有较高的同源性;中间结构域(Domain )，与它的目标酶SOD的序列相似性为50%，但是CCS缺少催化活性部位;C端结构域(Domainm)，大约30个氨基酸，是CCS的特异部位和功能必需基团，含有一个高度保守的CXC序列，Domainm在不同物种之间同源性很高。Domainl和Domainlll可以结合金属离子，Domalnl负责识别和捕获Cu+;Domainn与SOD结合成异源二聚体以固定SOD，利于离子的转运。Domainm负责将Cu+插入脱辅基SOD(apo一SOD)的金属离子结合位点，并将其激活。CCS与SOD单体形成的异源二聚体(CCS一SOD)较CCS、SOD的同源二聚体(CCS-CCS，SOD-SOD)构象发生了很大变化，可能更便于Cu+的转运，但是具体作用机制仍不清楚。有趣的是，CCS结合Cu+，而SOD结合Cu2+了，在转运过程中，Cu+是如何实现变价有待进一步研究。3)LYS7、CCS与SOD铜离子浓度的其他调控方