整理生物化学与分子生物学实验

1、生物化学与分子生物学实验1. 分光光度计（1） 基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯比尔定律，通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度。 （2） 吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为： A-lgTbc A：吸光度，又称光密度“O.D”；：吸光系数（L·mol1·cm1）；比例常数，称吸光系数b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。吸光度“A”具有加和性,即混合物的

2、总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M-1cm，计算其摩尔浓度. AbC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1×10-5 mol / L（2）等电点的计算方法；标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。（2）在测定条件相

3、同的情况下，分别测定其吸光度。（3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。2、 酪蛋白的提取过程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.8。利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白。(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠PPT后面问题：（1）醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？醋酸

4、缓冲液：调节PH到等电点4.8。蒸馏水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂类物质。丙酮洗涤：脱水。（2）最后所得的沉淀中加入0.1mol/L NaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定。（3）制备高产率 酪蛋白的关键是什么？刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到4.7,越接近越好,这是最主要的。（4）请设计另一种提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高浓度(NH4)2SO4溶液2、10000转/分,5分钟，去上清液3、95%乙醇4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液4、丙酮4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液5

5、、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、双缩脲法测蛋白质含量(1).蛋白质测定的5种方法: 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） TCA：三氯乙酸4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合，使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度A595，与蛋白质浓度成正比。(1).干扰物质有哪些？TritonX-100、SDS、强碱

6、性缓冲液等(2).G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基，染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。(3).PPT后的4个思考题。说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？ 只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g氮，试验中可以除去非蛋白氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是

7、相对于标准蛋白含量而言的。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些？(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等。(3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。在实验中，使用的水一定是蒸馏水吗？为什么？ 因为Bradford检测中要用的试剂配制,标准曲线的制作都要用到水.如果不是使用蒸馏水,可能水里面会有一些游离的离子或者电解质,会影响试剂配制

8、的准确性,干扰实验结果.而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应,这样制作的标准曲线会比实际值偏高,导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低。SDS干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么？当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族

9、氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。  要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。5、醋酸纤维薄膜电泳原理：生物分子在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向不同分子以不同速度移动。电泳影响因素： 蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、自身大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度等。(1).结合实验报告册，回忆操作过

10、程，首先醋酸纤维薄膜先看粗糙面，在粗糙面上画点样线，画好后做标记，泡在缓冲溶液中浸泡完全（上面无白斑），然后点样，点样后放掉电泳槽中电泳，电泳后染色，然后脱色。（熟悉整个过程，如果把过程打乱，能否正确排序？）（选择题）结果是5条带，哪条带最接近点样线，哪条线最远。要求会画图，画图要记得画点样线。(2).血清蛋白的临床意义。组成：白蛋白、1、2、和-球蛋白;功能：维持血浆胶体渗透压；调节血浆pH值，维持酸碱平衡；运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等；免疫作用。血清蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为6080g/L减少：长期慢性发热 、 大面积烧伤（白细胞增多）， 恶性肿瘤 、 肝癌（淋巴

11、细胞和核细胞增多） ， 肝功能严重受损 、 肝坏死 、 肝硬化（谷丙转氨酶增多） ， 甲状腺功能亢进 、 浆膜渗出性损害 、 结核病 、 慢性腹泻 、 慢性肝炎 、 肾病综合征 、 吸收不良综合征 ， 营养不良、贫血（红细胞，红蛋白稍偏低）等。增加：大量出汗 、 多发性骨髓瘤 、 腹泻 、 巨球蛋白血症 、 严重呕吐、中毒等。6、血糖测定（吴宪血糖测定法）(1).吴宪血糖测定法的优势（波长620nm）:优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多工作原理：葡萄糖 Cu(OH)2 Cu2OCu2O 磷钼酸 钼蓝钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比，所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定血糖的含量（波长6

12、20nm)。（2）为什么选用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果（3）水浴8min后，取出为何切记摇动？ 氧化亚铜易已被氧化（4）空腹血糖的正常范围：一般空腹全血血糖为3.96.1mmol/L(70110毫克/分升)，血浆血糖为3.96.9mmol/L(70125毫克/分升)。空腹全血血糖6.7mmol/L(120毫克/分升)、血浆血糖7.8mmol/L(140毫克/分升)，2次重复测定可诊断为糖尿当空腹全血血糖在5.6mmol/L(100毫克/分升)以上，血浆血糖在6.4mmol/L(115毫克/分升)以上，应做糖耐量试验。当空腹全血血糖超过11.1

13、mmol/L(200毫克/分升)时，表示胰岛素分泌极少或缺乏。因此，空腹血糖显著增高时，不必进行其它检查，即可诊断为糖尿病。（5）PPT后的3个思考题Folin-吴宪法为什么要用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多，缺点是费时，要精确控操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性比较差，干扰物质比较多进行比色法测定时，如果测得样品的A值超过100%，该如何处理，为什么？测得样品值超过100%是因为有其它还原物质，使其待测液中血糖的浓度过高所造成的，应该将待测液稀释后再进行比色

14、。7、谷丙氨酸酶的临床意义；（1）、谷丙氨酸酶的测定方法；知道什么是赖氏法，什么是改良赖氏法？ （2）、改良后的方法优势在哪？1.反应温度：40改为37；2.底物浓度：高改低；3.套用卡门氏单位，与速率法一致，反映了酶的真实活性（3）、在做实验时用到酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他们的原理以及试剂的作用； （4）、该实验的注意事项：2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果；在测定时，如酶活力较大（ 大于150KarU ），应将样品稀释后再进行测定。（5）、PPT后的6个思考题1、 ALT的临床意义? AST的测

15、定对于肝病的诊断具有十分重要的意义，特别是AST/ALT比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义，是临床诊治肝病的重要指标之一2、血清谷丙转氨酶测定的注意事项？以及为何要 避免溶血？常温下标本不宜久存，（2）严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照组（3）当标本的酶活性超过150K时，应将血清中用0.145mol/L氯化钠稀释重做，其结果乘以稀释倍数（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接显色物，NAOH的浓度与显色深浅有关，因此它们的浓度必须很准确（5）丙酮酸标准浓度要求十分精确（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后应充分混

16、匀当溶血之后，红细胞中的ALT会进入血液中，导致测得的实验数据较大，不符合实际情况3、对照管的意义是什么? 减少非试验因素对实验结果的影响4、底物液为何要37预温5min? 人体的体温为37，只有在此温度下酶的活性才会达到最大，因此必须先让酶的活性达到最大才与底物反应5、为什么在制作标准曲线时要加入基质液？使反应的溶液体积相同，减少因体积不同而造成的实验非决定性因素的影响 6、为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同，对反应没有影响？基底液与底物和酶都不反应，它的作用只是调节溶液的体积酶活性的单位：国际单位：1961年酶学委员会建议使用统一单位，在规定条件下，1分钟内转化1 mol底物所需的

17、酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。8、猪肝基因组的提取实验原理一定要掌握。提取过程中用到的试剂作用；PPT后的思考题（1） 实验原理：DNA与RNA的分离： DNP在0.14M NaCl盐溶液中溶解度很低，而RNP则溶于0.14MNaCl盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开。DNA在高浓度的盐溶液中溶解度最大。去除DNP中的蛋白：SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶）。进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中。沉淀DNA：利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA 从溶液中沉淀出来。提取过程中用到的试剂作用

18、1、取新鲜猪肝4g，用0.14mol/L NaCl-0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10mL 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨。（初步破碎细胞）。（已做）2、取一支10 mL EP管，装入糊状物（基本装满），离心5 min（10000rpm），弃去上清液。沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗两次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl -0.15mol/L EDTA溶液5m

19、L，然后每管滴加25%的SDS溶液1mL，边加边振荡。加毕，置60水浴10min （不停振荡），直至溶液变得粘稠并略透明，取出冷却至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液2mL，蝴蝶形振荡5min。加入约1倍体积的氯仿异戊醇混合液，蝴蝶形振荡5min，离心10min（4000rpm）。 （此步骤后溶液分三个相：上层水相（DNA）；中层变性蛋白质相；下层有机相和残余的RNA。） 5、吸出上清液，弃去沉淀。向上清液中缓慢加入1.52倍体积的95%乙醇，DNA沉淀析出，离心（4000rpm）5min用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA6、制备DNA溶液： 用0.1mol

20、/L的NaOH 1mL,溶解DNA沉淀，为下次的DNA含量测定提供材料PPT后的思考题1. 核酸提取中SDS、氯仿-异戊醇各有什么作用？SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。氯仿可去除DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡2. 结合本

21、人操作的体会，试述在提取过程中应应该注意些什么？且如何避免大分子DNA的降解和断裂？震荡过程中力度不能过大，力度过大会导致DNA分子断裂，也会影响实验的结果。离心时间应适合，时间太长可能会导致DNA分子断裂，时间太短，会导致DNA分子不能得以与蛋白质分离，水浴时间与温度应该适宜，温度为65度时间为6分钟最适合。3. 核酸提取过程中，除去杂蛋白的方法主要有哪几种？4种：紫外线吸收法，定磷法，二苯胺法，地衣酚（苔黑酚）法4. 预习：核酸定量测定方法有几种？9、DNA样品含量的测定（有5种方法；我们做了紫外法和二苯胺法，其他方法要掌握实验原理，做实验的两种方法不仅要掌握实验原理，还要掌握操作过程。）

22、二苯胺法实验原理 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大光吸收。 DNA在40-400ug范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。紫外吸收法实验原理 DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性10、质粒DNA提取（掌握实验原理，试剂的作用；什么叫做质粒

23、？质粒的结构？质粒有什么特点？我们用碱裂解法，该法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；以及最后的实验步骤和注意事项；PPT后的3个思考题。）二苯胺法实验原理 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大光吸收。 DNA在40-400ug范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法这种方法是根

24、据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们质粒的结构特点：1、染色体外的小型DNA分子；2、共价闭合环状超螺旋结构;3、自主复制。作用 ： 1、 外源DNA的载体 2、保存基因 3、表达蛋白用碱裂解法，该法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲) 50 mmol/L葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（悬浮细胞） 25 mmol/L EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用） 10 mmol/L Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）溶液

25、II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) 0.2 mol/L SDS：？ 1% NaOH（PH>12）：破坏细胞膜，裂解细胞 注意：碱裂解的时间不要太长，以免基因组DNA断裂成小片 段。溶液III： 3mol/L HAc（pH4.8） 和 3mol/L KAc 组成的高盐溶液 (复性，分离) HAc溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 KAc会与SDS形成溶解度很低的盐POD(十二烷基磺酸钾)，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。PPT后的3个思考题。质粒提取

26、除了碱裂解法，还有其他什么方法？各种方法的优缺点？核酸提取过程中，除去杂蛋白的方法主要有哪几种？如果质粒DNA中有蛋白质残留，如何判断？在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？11、PCR技术（知道操作中加了哪些试剂？试剂的作用是什么？PCR的原理主要是3个步骤：变性，退火，延伸。过程是什么样的？PCR的特性。）（1）、过程：首先95预变性设置1min，1min后94 30s进入变性过程；然后是退火52 30min；然后引物的延伸，72 30s，从这开始循环，72 10min，最后0保温。（2）、试剂的作用是什么？（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶的用量为12.5U/100ul,

27、酶的浓度偏高，非特异性的产物将会增加，若酶的浓度偏低，侧合成产物偏少。 Taq DNA聚合酶可分为两大类： 1、具有校正功能的（有3'5'核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （无3' 5'核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶（二）模板核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNa

28、se降解RNA。（三）引物 引物是待扩增核酸片段两端的已知序列，它决定了PCR扩增产物的大小，引物的选择是整个PCR反应的关键，引物的优劣直接关系到PCR的特异性及成功与否。 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 （2）、PCR的原理主要是3个步骤：变性，退火，延伸。过程是什么样的？过程：首先95预变性设置1min，1min后94 30s进入变性过程；然后是退火52 30min；然后引物的延伸，72 30s，从这开始循环，72 10min，最后0保温1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩

29、增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。（3）、PCR的特性 1、特异性强：PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、Taq DNA聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性。 2、灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的。 3、简便快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA仪中进