水果中诺如病毒检测方法的的优化

1、Journal of Virological Methods水果中诺如病毒检测方法的优化Hee-Yeon Kima, In-Shin Kwakc, In-Gyun Hwangc, GwangPyo Koa,b摘要：食品中诺如病毒(NoV)的检测对于食源性诺如病毒引起的爆发性疾病的研究和预防至关重要。然而，目前诺如病毒的检测方法还未有得到很好的检验或优化。本研究中，对不同水果中NoV的洗脱、PEG富集病毒以及使用RT-PCR提取病毒RNA的各种有效的方法皆进行了优化。首先，对6种不同的缓冲液进行水果表面NoV病毒的洗脱的方法评估。即将已知量的诺如病毒喷洒于葡萄、草莓、树莓表面，采用蒸馏水、0.0

2、5M甘氨酸-0.14M NaCl(pH 7.5)、2.9%胰蛋白磷酸肉汤-6%甘氨酸、100 mM Tris HCl(pH 9.5)、50mM甘氨酸-50mM MgCl2(pH 9.5)和3%的牛肉浸出物等6种缓冲液进行洗脱，RT-PCR检测结果表明：3%的牛肉浸出物对病毒的洗脱效果最佳。其次，对检测诺如病毒最常用的沉淀剂-PEG分别进行了不同分子量、作用时间和温度等三个因素的进行了评估，结果表明：PEG 10000，4h，室温条件为最佳。最后，对5种不同的RNA提取方法进行评估，表明：QIAamp Viral RNA Mini kit提取效果最佳。采用优化后的方法对不同水果总诺如病毒的检测显

3、示，将近6-80%的NoV病毒粒子可以检出。关键词：诺如病毒；胃肠炎；水果；洗脱；PEG沉淀；核酸提取1. 引言食物传播性病毒感染是人类疾病的重要因素(Mullendore et al., 2001; Myrmelet al., 2000)，NoVs在遗传和抗原上属杯状病毒属(Rutjes et al., 2006)，为人类非细菌性肠胃炎的重要的病原体(Mead et al., 1999; Vinje et al., 1997, 2003)。诺如病毒易感染的场所主要有老人院(Calderon-Margalit et al., 2005)、医院、游船、学校、餐馆和一些宴席上(Parashar e

4、t al., 1998; Rutjes et al.,2006)。农作物成长阶段的水体污染以及食品加工和包装过程皆可以引起食品感染诺如病毒。诺如病毒感染的典型食物为带生的、未煮熟的肉或海鲜（如贝类）、方便食品以及水果和蔬菜等具有日常消费的食物(Bosch et al., 2001; Daniels et al., 2000; Guevremont et al., 2006; Hutin et al.,1999; Le Guyader et al., 1994; Potasman et al., 2002; Rosenblum et al., 1990; Rutjes et al., 2006)

5、。因为这些食物都缺少热处理，因此都具有很高的感染风险。然而，由于缺乏合理的检测方法以及食物样品取样不便等因素使得诺如病毒引起的食物感染很少能被检测到(Cliver, 1995)。进一步的研究表明，葡萄、草莓和树莓等许多水果为许多NoV感染的基质(Butot et al., 2007; Hill, 2003; Le Guyader et al.,2004)。因此，开发和优化NoV的检测方法对于预防和调查NoV的爆发具有重要意义。但是目前检测诺如病毒方法很少，并且限制于某些食物种类，如大部分诺如病毒的检测是针对贝类产品的(Baert et al., 2007; Dubois et al., 200

6、2; Heller et al., 1986; Jaykus et al., 1996; Kingsley and Richards, 2001; Schultz et al., 2007; Shieh et al., 1999; Sunen and Sobsey, 1999)。本研究评估和优化了水果中诺如病毒检测的所有步骤，包括水果中病毒的洗脱、采用PEG进行病毒的富集以及RNA的提取。本研究旨在于（1）发现NoV洗脱的最佳缓冲液，（2）PEG沉淀病毒的最佳条件，（3）通过RNA提取对病毒进行洗脱液和沉淀剂进行比较。2. 方法与材料2.1粪便样本和RT-PCR测定NoV G-4为引起许多食源

7、性疾病爆发的基因型，检测样本为韩国疾控中心获得的感染诺如病毒的粪便，将其进行一系列的稀释后，采用RT-PCR进行定量检测。移取以10%悬浮于PBS中的粪便稀释物140L，采用QIAmp Viral RNA Mini Kit试剂盒进行病毒RNA的提取。RT-PCR采用靶点病毒基因的衣壳编码区设计两组引物(Isakbaeva et al., 2005)，分别为：G2-SKF和G2-SKR，扩增产物为344bp(Kojima et al., 2002)。病毒RNA的反转录条件为42，60min，然后95，15min激活Taq酶，94 1min，40 1min，72 1min，共40个循环，最后72延

8、伸10min，每个循环都设阴性对照以控制反应过程。扩增产物以2%的含有EB的凝胶电泳检测。结果显示，粪便样本中NoV/G-4的浓度约4×106 RT-PCR/mL，所有的粪便样品储存于-70备用。2.2不同水果中NoV洗脱缓冲液的优化本研究共对6种不同的缓冲液进行评估(Baert et al., 2008; Dubois et al., 2002; Guevremont et al., 2006; Lewis and Metcalf, 1988; Monpoeho et al., 2001;Mullendore et al., 2001)，包括：（1）蒸馏水；（2）3%的牛肉浸出物（

9、pH 7.1）；（3）0.05 M甘氨酸-0.14M NaCl (pH 7.5)；（4）2.9%胰蛋白胨磷酸肉汤-6%甘氨酸；（5）100mM Tris-HCl(pH 9.5)；（6）50mM MgCl2(pH 9.5)。首先，取10 L 4×106 RT-PCR/mL 感染诺如病毒的粪便悬浮液接种到20g新鲜葡萄、草莓或冷冻树莓中。接种的水果在超净台内静置30 min使得病毒充分吸附，加入上述6种缓冲液，室温200 rpm孵育5h。随后加入等体积的氯仿，漩涡震荡混匀，2000g，4离心10min，取上清液(Monpoeho et al., 2001)。然后加入PEG 8000使得上

10、清液的终浓度为8 %，震荡混匀，4孵育过夜（不时震荡）。12,000g，4离心30min，去上清，加2mL PBS重悬浮沉淀。采用QIAmp Kit试剂盒提取上述悬浮液，然后采用 OneStep PT-PCR kit 进行PCR扩增。以最后扩增出来的病毒含量与接种到水果表面的病毒含量的比值计算回收率，共做2个平行。2.3PEG沉淀剂的优化对PEG的优化共进行了3个方面，包括：（1）PEG的分子量；（2）PEG沉淀剂作用的时间；（3）PEG沉淀剂作用的温度。分别采用蒸馏水、3%牛肉浸提物、0.05M甘氨酸-0.14M NaCl等三种洗脱液加入葡萄、草莓、树莓三种水果， 200rpm孵育5h。随后

11、接种10 L NoV病毒粪便悬浮液（4×104 PT-PCR units）于上述洗脱液中。接种的NoV病毒粪便悬浮液混合MW为6000、8000、10000和20000的PEG，使其在病毒粪便悬浮液中的最终浓度为8%，pH为7.2。漩涡震荡混匀，室温孵育4h或4过夜。4，12000g离心30min。去上清，2 mL PBS悬浮沉淀。将悬浮物进行一系列稀释，进行病毒RNA的提取以及RT-PCR，共做三个平行。将NoV病毒RNA进行10倍稀释后采用MPN法（最大可能数）进行NoV的定量。将稀释后的样品的PT-PCR阳性数目与阴性数目参照MPN表计算病毒RNA浓度和置信限度(De Man,

12、 1983)。病毒的回收率为PT-PCR后的病毒量与样本中接种的病毒量之比。2.4 RNA提取的优化本研究采用5种不同的方法进行了病毒RNA的提取分别为：（1）热释放法；（2）硅胶膜法QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)；（3）磁珠法(MagExtractor Viral RNA Purification Kit, Toyobo)；（4）TRIzol试剂法；（5）免疫磁珠分离法。待检的葡萄、草莓、树莓三种水果中分别接种10 L NoV粪便悬浮液，加入3%的牛肉浸出物进行洗脱。洗脱完毕后，加入PEG 10000，4孵育4h。然后采用上述5中方法进行病毒RNA（-8

13、0备用）的提取，并取2.5 L的病毒RNA进行25 L体系的PT-PCR反应，每种方法做三个平行。采用热释放法提取RNA时，将PEG沉淀物95加热10min后立即于冰上降温。 磁珠法等方法提取病毒RNA严格按照MagExtractor Viral RNA Purification Kit试剂盒说明书进行。硅胶膜法提取RNA采用QIAamp kit，取140 L RNA加入560 L的异硫氰酸盐，再加入等体积的96-100%的乙醇进行中和，然后用QIAamp Mini Column试剂盒进行病毒RNA 的纯化。采用TRIzol法提取RNA时，将PEG沉淀物以2mL的PBS进行悬浮，取淀悬浮液30

14、0 L，加入700L的TRIzol试剂，混匀，室温静置5min。加入150L的氯仿，震荡混匀，室温静置15min，4，108g离心15min。上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，-20孵育4 h，4 ，10844 g离心30 min，弃滤液。加入1 mL的75 %乙醇洗脱沉淀，晾干后加入15 L无RNA酶的水进行溶解。采用免疫磁化分离法提取NoV RNA，将1 mg/mL的免疫磁珠悬浮液震荡1 min，充分溶解，加入33 L的磁珠颗粒到磁粉颗粒集中管中，作用2 min直至磁珠移至管的一边，溶液变得澄清。从管的另一边小心移取去清液，使磁珠呈稳定状态。加入0.1M Na- PBS（pH

15、7.4）室温洗脱磁珠三次后，加入1 mL的0.1M Na-PBS（pH 7.4）（含有5-10 L的兔病毒衣壳IgG抗血清），未结合的抗血清用含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS （pH 7.4）4洗脱4次进行去除。进行免疫磁化分离的病毒洗脱液加入1/10氯仿进行萃取，PEG沉淀按上述操作进行，并加入1.5 mL PBS进行重悬浮。然后将抗体结合免疫磁珠慢慢加入1.5 mL的上述悬浮液，于MX4混合仪上室温旋转混合1 h。孵育完成后，采用上述描述的MPC进行分离，用含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS （pH 7.4）4洗脱3次，以50 L的DEPC处理水进行重悬浮后移至Eppendorf 管中备

16、用。2.5 数据分析PEG沉淀法比较分析采用方差分析或KruskalWallis非参量检验。RNA提取方法的比较采用MannWhitney检验。所有的统计分析的完成均采用SPSS进行分析，差异显著为p<0.05。3. 结果3.1洗脱缓冲液采用6种洗脱缓冲液对葡萄、木霉和草莓表面NoV病毒进行洗脱（表1），结果显示：总体来讲，从葡萄表面洗脱病毒比从草莓表面洗脱病毒的效率高，草莓中NoV的回收率8.5%（最低检测限）。采用50mM甘氨酸-50mM MgCl2（pH 9.5）对葡萄表面进行病毒洗脱时病毒回收率最低，而采用蒸馏水、0.05M甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）、2.9%胰

17、蛋白磷酸盐-6%甘氨酸均低于最低检测限（8.5%），其中采用3%的牛肉浸提物对葡萄和草莓两种水果病毒洗脱具有最高的病毒回收率。表1 6种不同的洗脱缓冲液对葡萄和草莓表面NoV的洗脱效率洗脱缓冲液洗脱效率a葡萄草莓蒸馏水21<8.5b3%牛肉浸提物21850.05M甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）21<8.52.9%胰蛋白磷酸盐-6%甘氨酸<8.5100mM Tris-HCl（pH 9.5）218.550mM甘氨酸-50mM MgCl2（pH 9.5）218.5总体平均回收率17.921.3a：洗脱效率为NoV的回收量与NoV的接种量的百分比，洗脱效率表示的为双份试

18、验样品的平均值。b：低于最低检测限（8.5%）。3.2 PEG沉淀PEG的分子量对于不同洗脱液后NoV病毒的沉淀效果的影响见表2。四种不同分子量的PEG沉淀剂的实验结果显示，PEG10,000的病毒回收率最高，为17.8%，PEG6000、PEG8000、PEG20,000的病毒平均回收率分别为：9.2%、15.5%，其中病毒平均回收率范围为4.3-19.9%，比草莓的检测限（2.6%）低草莓的50.4%，树莓的为6.6-9.4%。PEG分子量的所有试验结果表明，具有最高回收率的洗脱缓冲液为3%的牛肉浸提物，草莓中病毒回收率最高的为3%牛肉浸提物+ PEG10,000的病毒回收率最高，但其回收

19、率与其他PEG的病毒回收率相比没有明显的统计学意义（方差分析试验，p=0.67）。表2 PEG分子量对于不同洗脱缓冲液洗脱后NoV沉淀的影响水果种类洗脱缓冲液aPEG分子量6000800010,00020,000葡萄A3.4b(0.4-17.2)c<2.6(0.4-7.7)7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-17.2)B3.4(0.4-17.2)19.7(3.4-100)19.7(3.4-103)19.7(3.4-100)C7.7(0.9-30.9)<2.6(0.4-7.7)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)草莓A12.9(2.6-39.8)6(0.9-19

20、.7)3.4(0.4-17.2)7.7(0.9-30.9)B18(3.4-40.3)79.8(12.9-100)85.8(30.9-100)18(3.4-40.3)C<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)<2.6(0.4-7.7)木莓A18(3.4-100)12.9(2.6-39.8)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)B9.4(2.6-30.9)6(0.9-19.7)9.4(2.6-30.9)3.4(0.4-17.2)C7.7(0.9-30.9)7.7(0.9-30.9)7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-

21、17.2)总计9.215.517.87.2a：A：蒸馏水；B：3%牛肉浸提物；C：0.05M甘氨酸-0.14M NaClb：按初始接种量为100%计算NoV的回收百分率。c：95%的置信区间，采用MPN表对三个独立的实验计算NoV的病毒回收率。PEG沉淀孵育的时间同样也影响NoV的病毒回收率，见表3。总体来讲，4h的PEG孵育时间优于过夜孵育，且无论何种条件下，3%牛肉浸提物为最佳洗脱缓冲液。采用4h孵育时，分子量低的PEG的病毒回收率较低，采用3%的牛肉浸提物作为洗脱缓冲液时，PEG6000和PEG8000的病毒回收率分别为12.9%和8.6%，PEG10,000和PEG20,000的病毒回

22、收率为51.9%和58.4%。然而采用过夜进行PEG孵育时，病毒回收率最高的为PEG10,000。KruskalWallis非参数比较结果表明，过夜进行PEG孵育和4h孵育没有显著的统计学意义(P=0.543)。表3 PEG孵育时间对于不同洗脱缓冲液中NoV病毒沉淀的影响PEG MW洗脱液aPEG孵育过夜PEG孵育4h草莓木莓草莓木莓6,000A12.9b(2.6-37.8)c18(3.4-40.3)3.4(0.4-17.2)12.9（2.6-37.8）B18(3.4-40.3)9.4(2.6-30.9)12.9（2.6-37.8）12.9（2.6-37.8）C<2.6(0.4-7.7)

23、7.7(0.9-30.9)18(3.4-40.3)12.9（2.6-37.8）8,000A6(0.9-19.7)12.9(2.6-37.8)3.4(0.4-17.2)7.7(0.9-30.9)B79.8(12.9-100)6（0.9-19.7）7.7(0.9-30.9)9.4(2.6-30.9)C<2.6(0.4-7.7)7.7（0.9-30.9）12.9(2.6-37.8)6(0.9-19.7)10,000A3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)B85.8(30.9-100)9.4(2.6-30.9)18(3.4-40.

24、3)85.8(30.9-100)C<2.6(0.4-7.7)7.7(0.9-30.9)12.9(2.6-37.8)3.4(0.4-17.2)20,000A7.7(0.9-30.9)3.4(0.4-17.2)<2.6(0.4-7.7)12.9(2.6-37.8)B18（3.4-40.3）3.4(0.4-17.2)36.9(6-100)79.8(12.9-100)C<2.6(0.4-7.7)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)3.4(0.4-17.2)总计20.27.711.930 a: A：蒸馏水；B：3%牛肉浸提物；C：0.05M甘氨酸-0.14M NaClb

25、:按初始接种量为100%计算NoV的回收百分率。c: 95%的置信区间，采用MPN表对三个独立的实验计算NoV的病毒回收率。3.3 RNA提取方法采用5种不同的病毒RNA提取方法获得得NoV回收率见表4，众多方法中，QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA的病毒回收率最高，其中葡萄的病毒回收率为80%（采用MPN表指示单位体积初始样品的最近似数），其次依次为热释放法、免疫磁化分离法、磁珠法和TRIzol法。草莓和木莓的病毒回收率普遍低于葡萄且二者回收率相近，其中采用QIAamp kit法的病毒回收率分别为6%和8%。采用其他的RNA提取方法，病毒回收率的范围从未检测（TRI

26、zol）出到8%（热释放法）。一些RNA的提取方法与它们的回收效率有显著差异（KruskalWallis检测，p=0.025）。表现出显著性差异的有QIAamp kit与Toyobo MagExtractor ki（p=0.046）t和TRIzol法(p=0.05)之间的差异，然而它与热释放法和免疫磁化分离法无显著差异（p>0.05）。表4 不同RNA提取方法对NoV回收率的影响RNA提取方法水果回收率（%）a（95%置信限度）P值bQIAampViral RNA Mini Kit葡萄80（12.9-100）n/a草莓8（0.9-19.7）木莓6（2.6-9.3）热释放法葡萄14（2-4

27、2）0.658草莓8（1-40）木莓6（1-26）Tpyobo Mag Extract葡萄1.8（0.2-7.2）0.046草莓1.8（0.2-7.2）木莓4.2（0.8-9.4）Trizol 试剂法葡萄0.4（0.1-2）0.050草莓1.5（0.3-4.4）木莓<0.3（<0.3）磁珠免疫分离法葡萄8.6（1.4-4.2）0.121草莓3（0.6-8.8）木莓3（0.6-8.8）a：按初始接种量为100%计算NoV的回收百分率。其回收率通过查三个独立实验的MPN表获得。 b：通过Mann-Whitney实验评估p值，以及比较QIAamp Viral RNA Mini Kit和其

28、它核酸提取的方法。4. 讨论尽管NoV为引起食源性疾病的重要病原之一，但是其在食物中的检测方法的研究尚未成熟。在NoV爆发的许多案例中，调查者对应于可疑的食物很少能加以辨别确认，原因如下：(Guevremont et al., 2006)（1）可疑食品难以获得；（2）不能采用常规方法对NoV进行培养；（3）从食物中富集病毒的方法效率较低(Rutjes et al., 2006)。NoV不能像其它细菌性食源性病毒一样可以再培养基中培养和浓缩，它既不能在体外培养也不能在体内浓缩。由于这些原因，NoV的检测和浓缩需要从被污染的食物中进行洗脱后进行浓缩。特别典型的是，食品中NoV的含量很低，且存在很多

29、化学成分对 NoV的检测具有抑制作用。众多的因素表明，优化洗脱和浓缩方法对于食品中NoV的检测具有重要意义。典型的NoV检测过程包括：洗脱、PEG沉淀浓度、RNA提取和RT-PCR检测。针对NoV的检测，多数研究集中于贝类中NoV的检测，然而，水果和蔬菜亦是食源性疾病爆发性多的种类之一(Butot et al., 2007)，因此从不同水果中评价NoV的回收率及其重要。本研究则对不同水果中NoV的洗脱、浓缩和提取进行了优化。为检验洗脱液的洗脱效率，本研究对已有研究中用到的所有洗脱缓冲液进行了检测(Baert et al., 2008;Dubois et al., 2002; Guevremon

30、t et al., 2006; Lewis and Metcalf,1988; Monpoeho et al., 2001; Mullendore et al., 2001)。在所检测的6种洗脱缓冲液中，3%的牛肉浸提物对于NoV的洗脱效率最高，可能是其具有高的浓缩蛋白造成的。从目前草莓和速冻树莓中NoV的洗脱效率的研究显示，100mM Tris缓冲液的洗脱效率范围为0.42%-11.2(Butot et al., 2007)，本研究洗脱效率为8.5%，与其研究结果一致。Tirs缓冲液中加入1%的牛肉浸提物对草莓和树莓的病毒洗脱率分别提高了2.2和3.6倍。这个结果与目前关于浆果中牛肉浸提物的

31、特定蛋白可促进NoV的洗脱的研究结果相一致。本研究对于PEG MW和孵育时间对于病毒沉淀的影响首次进行了研究，PEG由于其快速和温和的方法应用浓缩病毒，能够在中性pH值和不含其它化学物质的高离子浓度的溶液中作用(Lewis and Metcalf, 1988)。尽管怀疑增加PEG MW可能会增加NoV从洗脱液中的回收率，但本研究结果不支持这个观点，且认为延长PEG的孵育时间对于提高病毒回收率毫无意义。本研究采用PEG沉淀病毒的回收率为12.4%，低于已有研究的甲肝病毒回收率（13-27%）(Mullendore et al., 2001)，但是高于已有研究的NoV的回收率（1-7%）(Buto

32、t et al., 2007; Rutjes et al., 2006)。这种不同可能是由于洗脱缓冲液中蛋白质和其它成分的不同引起的结果。本研究采用3%牛肉浸提物进行病毒洗脱后进行PEG沉淀具有很高的效率，可能是由于牛肉浸提物中的高浓缩蛋白促进了PRG对于NoV的絮凝作用。食品中有许多成分对分子检测如PT-PCR具有抑制作用(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab and McDevitt, 2003)。这个问题在浆果（如草莓、木莓等）检测中尤为显著，其主要原因为检测过程中存在化学抑制剂和浆果比较低的pH值(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab

33、 and McDevitt, 2003)。迄今为止，NoV被认为是少量蔬菜和水果中存在的天然病洗脱（21-85%回收）3%牛肉浸提物氯仿提取PEG沉淀（10%-86%回收）PEG10,0000/n 4孵育（草莓）室温4h孵育（木莓）核酸提取（6-80%回收）QIAamp Viral RNA Mini KitPT-PCR 图1 水果中NoV的检测方法的优化和用于病毒检测的样品回收量毒(Calder et al., 2003; Hernández et al., 1997; Kobayashi et al., 2004; Le Guyader et al., 2004)。本研究病毒检测的

34、操作过程包括：3%的牛肉浸提物进行病毒洗脱、PEG 10,000室温孵育4h、QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA、水果中NoV的检测（图1）。 已有的研究认为牛肉浸提物中含有许多PT-PCR抑制剂(Katayama et al., 2002; Schwab and McDevitt, 2003)，但是在本研究中未发现有明显的PT-PCR抑制因子，其原因可能为由病毒RNA提取过程中抑制因子已被有效去除。本研究共评估了5种NoV中提取RNA的方法，评价病毒RNA提取方法的因素包括该提取方法与先前洗脱和浓缩步骤的相容性、从先前病毒颗粒中提取RNA的效率和PT-PCR抑制剂去

35、除的能力。本研究对没一种RNA提取方法都进行了测试，其中采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的病毒回收最高，其次为免疫磁化分离法。然而，免疫磁化分离法提取的效率取决于所使用抗-NoV抗体的类型和质量，抗体抵抗不同类型的NoV的确认试验需进行进一步研究。尽管本研究采用PT-PCR进行NoV的检测，但是其他的一些分析检测方法，如电镜检测方法或酶联免疫方法皆可进行使用。众多NoV检测方法中，PT-PCR由于其快速和高灵敏性和特异性，为最通用的检测方法。本研究通过一系列稀释和常规PT-PCR检测进行病毒回收率的量化，但是更多的定量方法如实时PT-PCR检测应该用于取代RT-PCR

36、。目前的方法的一个局限性在于由于分析检测不能区分感染性病毒和非感染性病毒的区别，故未能提供NoV感染率的相关信息（Straub et al. (2007)。目前已有一种NoV的体外三维培养系统，但是该系统的以应用比较困难和昂贵，且仅有一部分类型的NoV可以采用该种方法进行培养。除此之外，鼠类诺如病毒（MNV）亦可作为人类NoV研究的替代品，MNV容易培养并采用RAW264.7细胞系进行菌斑实验，该方法可以实现病毒感染性的量化(Karst et al., 2003;Thackray et al., 2007)。然而，MNV表现为不同的特征，且替代品病毒具有局限性。因此，研究与PT-PCR检测相一

37、致的病毒洗脱和浓缩方法具有很重要的现实意义。目前，尚未有不同NoV感染水果的标准化的检测方法，鉴于NoV在食源性疾病中的重要性，评价和优化食品中NoV的检测方法具有重要意义。本研究中优化的NoV检测的操作步骤可用于NoV相关的疾病爆发性检测。该方法对于食源性疾病的调查和食品的监测极其重要，下一个研究方向为其它重要食品基质中病毒洗脱和浓缩等操作条件的优化。致献本研究部分基金来自韩国食品和药品管理局（授权#06042）。参考文献1.Baert, L., Uyttendaele, M., Debevere, J., 2007. Evaluation of two viral extraction m

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