宋存江生物技术概论4.发酵工程

1、 4 发酵工程发酵工程学习目的学习目的 掌握发酵工程的基本类型和基本原理，了解典型发酵产品的生产工艺，认识发酵的基本过程及常用的发酵设备。 发酵工程是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。 它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。 4 发酵工程发酵工程发酵的定义发酵的定义 发酵（fermentation）最初来自拉丁语“发泡”（fervere），是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生co2的现象。 生物化学上将发酵定义为“微生物在无氧时的代谢过程”。 目前，人们把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其

2、代谢产物的过程统称为发酵。 引言引言是利用微生物的生长繁殖和代谢活动以及特定功能，通过是利用微生物的生长繁殖和代谢活动以及特定功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。是将传现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。是将传统发酵与现代的统发酵与现代的dnadna重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。起来的现代发酵技术。微生物菌体发酵 微生物酶发酵 微生物代谢产物发酵微生物的转化发酵 生物工程细胞的发酵4.14.1 发酵工程概况发酵工程概况4.1.14.1.1 发酵类型发酵

3、类型 4 发酵工程发酵工程微生物代谢产物微生物代谢产物 在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。 在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。 4.1.1 发酵类型发酵类型微生物代谢产物类型微生物代谢产物类型 产业 微生物代谢产物 医药 抗生素，药理活性物质，维生素，抗肿瘤剂、基因工程药物、疫苗等 食品 氨基酸，鲜味增强剂，脂肪酸，蛋白质，糖与多糖类，发酵剂，脂类，核酸，核苷酸，核苷、维生素、饮料等 农业 动

4、物生长促进剂，除草剂，植物生长促进剂，灭害剂，驱虫剂，杀虫剂等 轻工 酸味剂，生物碱，酶抑制剂，酶，溶媒，辅酶，表面活性剂，转化甾醇和甾体，有机酸，乳化剂，色素，抗氧化剂，石油等 其他 离子载体，抗代谢剂，铁运载因子等 4.1.1 发酵类型发酵类型微生物的转化发酵4.1.2 发酵技术的特点发酵技术的特点 发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成。 反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单。 原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源（如植物秸秆、木屑等），微生物本身能有选择地摄取所需物质。 4.1 发酵工程概况发酵

5、工程概况 容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应。 发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。 4.1.2 发酵技术的特点发酵技术的特点4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用 抗生素、维生素、激素 疫苗和菌苗等 4.1 发酵工程概况发酵工程概况 粘细菌（myxobacteria）是一类能够产生多种生理活性物质的微生物。近10年的研究已经昭示出粘细菌具有广阔的开发利用空间。在20世纪70年代，首次报道粘细菌产生的活性次级代谢产物是三烯吡喃菌素（ambruticin）。目前已从粘细菌中发现了大

6、约600多种生理活性物质。与其它的药源菌相比，粘细菌具有独特的优势和巨大的潜力。埃博霉素产生菌埃博霉素产生菌- -纤维堆囊菌营养细胞纤维堆囊菌营养细胞（山东大学李越中教授提供）（山东大学李越中教授提供） 是一种新的16元环多酮大环内酯，含有一个噻唑基和环上的一个环氧结构。该菌产生a和b两种主要组分,c-f四种次要组分以及36种极微量成分。这类物质的作用机制与紫杉醇类相似，它与微管蛋白结合，干扰细胞骨架的形成，起到抗肿瘤作用。近年来，对这类物质的化学合成，构效关系以及药效学等的研究进展很快，有望成为比紫杉醇更好的临床抗肿瘤药物。图15-20所示为从纤维堆囊菌发酵液中分离到的埃博霉素a，b，c，d

7、和f的化学结构。埃博霉素类抗肿瘤物质埃博霉素类抗肿瘤物质粘细菌粘细菌 soarngium cellulosum 产生的埃博霉素类化学结构产生的埃博霉素类化学结构食品工业 微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类 食品添加剂（柠檬酸、乳酸、天然色素等） 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用能源工业 酒精 沼气 氢能 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用化学工业 可降解的生物塑料 化工原料（乙醇、丙酮、丁醇、癸二酸等） 生物表面活性剂及生物凝集剂 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用 利用微生物合成生物降解材料利用微生物合成生物降解材料 -聚羟基脂肪酸脂聚羟基脂肪酸脂 (polyhydr

8、oxyalkanoate pha)众所周知，微生物的营养因素包括：碳源、氮源、无机盐、众所周知，微生物的营养因素包括：碳源、氮源、无机盐、微量元素、水和生长因子（氨基酸、维生素和嘌呤或嘧啶）微量元素、水和生长因子（氨基酸、维生素和嘌呤或嘧啶） 当当 环境中，缺少氮源而碳源浓度又比较高时、一部分微生物体内就环境中，缺少氮源而碳源浓度又比较高时、一部分微生物体内就积累一些颗粒、被分离纯化后即为具有热塑性的生物降解高分子积累一些颗粒、被分离纯化后即为具有热塑性的生物降解高分子材料。现已知有材料。现已知有300余种细菌可以积累单体在余种细菌可以积累单体在90种以上的种以上的 pha pseudomon

9、as mendocina nk-01 pseudomonas mendocina nk-01 pha 从门多萨假单胞菌从门多萨假单胞菌nk-01基因组中获得的中长链基因组中获得的中长链pha合成酶合成酶 phac1基因构建重组载体基因构建重组载体pbsphac1，在，在e.coli jm109 中进行表中进行表达，以所构建的工程菌株进行达，以所构建的工程菌株进行pha的发酵量重组大肠杆菌合成的发酵量重组大肠杆菌合成的的pha结构分析表明，工程菌合成的结构分析表明，工程菌合成的pha中含有六碳和八碳单中含有六碳和八碳单体体冶金工业 黄金开采和铜、铀等金属的浸提 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术

10、的应用发酵过程的场所发酵过程的场所 微生物冶金微生物冶金-冶金装置冶金装置cufes2 + 2 fe2(so4)3 +2h2o + 3o2 cuso4 + 5feso4 + 2 h2so4 氧化亚铁硫杆菌氧化亚铁硫杆菌 和和 氧化硫硫杆菌氧化硫硫杆菌农业 生物固氮 生物杀虫剂 微生物饲料 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用环境保护 使用生物肥料，生物杀虫剂 降解有毒物质 净化废水废气，处理石油污染 4.1.3 发酵技术的应用发酵技术的应用发酵过程的场所发酵过程的场所 污水处理污水处理-污水处理池污水处理池发酵过程的场所发酵过程的场所 微生物采油微生物采油-油田油田依靠人工注水，依靠人工注

11、水，外加压力来保外加压力来保持地层的能量持地层的能量的方式进行开的方式进行开采。水驱后采。水驱后原原油采收率平均油采收率平均达到达到40 40 - - 45%45%。发酵过程的场所发酵过程的场所 微生物采油微生物采油-油田油田依靠人工注水，外加压力来保持地层的能量的方式进行开采。水驱后依靠人工注水，外加压力来保持地层的能量的方式进行开采。水驱后原油原油采收率平均达到采收率平均达到40 40 - - 45%45%。 驱油菌主要是通过对原油的降解，使得原油的组分发生变化，原油的流驱油菌主要是通过对原油的降解，使得原油的组分发生变化，原油的流动性变好。动性变好。驱油菌在生长代谢过程中，能够产生生物表

12、面活性剂等代谢产物，有效地驱油菌在生长代谢过程中，能够产生生物表面活性剂等代谢产物，有效地降低了油水间的界面张力；提高采收降低了油水间的界面张力；提高采收率潜力提高。率潜力提高。由于驱油菌的代谢作用和在位繁殖由于驱油菌的代谢作用和在位繁殖效应，使原油的渗流阻力进一步下降，效应，使原油的渗流阻力进一步下降，润湿性发生反转，原油被乳化成水包润湿性发生反转，原油被乳化成水包油型乳状液，孔隙中不可动油开始启油型乳状液，孔隙中不可动油开始启动动4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程 微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。 4 发酵工程发酵工程好氧性发酵好氧性发

13、酵 在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气。 如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵，利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程厌氧性发酵厌氧性发酵 在发酵时不需要供给空气。 如乳酸杆菌引起的乳酸发酵，梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程 固体发酵 液体发酵 敞口发酵 密闭发酵 浅盘发酵 深层发酵 液体深层发酵 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程生理活性物质生理活性物质微生物微生物底物底物伴孢晶体（细菌内毒素）伴孢晶体（细菌内毒素）苏云金芽胞杆菌（苏云金芽胞杆菌（bacillus thuringiensi

14、s)椰子果渣椰子果渣赤霉素赤霉素藤仓赤菌藤仓赤菌(gibberella fujikuroi)，串珠镰孢串珠镰孢(fusarium moniliforme)麸皮，玉米穗，木薯粉，麸皮，玉米穗，木薯粉，甘蔗渣等甘蔗渣等赭曲毒素赭曲毒素赭曲霉赭曲霉(a.ochraceus)，鲜绿曲霉，鲜绿曲霉(p.viridicatum)大麦，大米，玉米大麦，大米，玉米土霉素土霉素龟裂链霉菌龟裂链霉菌(streptomyces,rimosus)玉米穗玉米穗麦角类生物碱麦角类生物碱串珠镰孢串珠镰孢(fusarium moniliforme)甘蔗渣甘蔗渣头孢霉素头孢霉素顶头孢霉顶头孢霉(cephalosporium a

15、cremonium)大麦粒大麦粒头丙菌素头丙菌素带小棒链霉菌带小棒链霉菌(streptomyces clavuligerus)向日葵种子向日葵种子枯草菌溶血素枯草菌溶血素枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)豆渣豆渣环孢素环孢素丝状真菌丝状真菌(tolypocladium inflatum)麸皮麸皮抗真菌素抗真菌素枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)黏土及稻草复合培养基黏土及稻草复合培养基绿僵菌素绿僵菌素金龟子绿僵菌金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)大米糠大米糠 固态发酵生物活性物质固态发酵生物活性物质4.2.1 发酵

16、工业中的常用微生物发酵工业中的常用微生物 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 其他微生物 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程放线菌小白链霉菌小白链霉菌nk660的电镜照片的电镜照片 -聚赖氨酸结构简式聚赖氨酸结构简式 4.2.2 培养基培养基 培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程霉菌 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基 4.2.2.1 培养基的种类培养基的种类 4.2.2 培养基培养基细菌酵母菌4.2.2.2 发酵培养基的组成发酵培养基的组成 l碳源 葡萄糖、果糖 蔗糖、麦芽糖 淀粉、纤维素等 4.2.2 培养基培养基

17、l氮源 有机氮源（黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉等） 无机氮源（氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等） 4.2.2.2 发酵培养基的组成发酵培养基的组成l无机盐和微量元素 磷酸盐、硫酸盐、氯化钠、氯化钾 镁、铁、钴、锌、锰等 4.2.2.2 发酵培养基的组成发酵培养基的组成蓝藻l生长因子 维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和一些动植物组织的浸液，是生长因子的丰富来源。 4.2.2.2 发酵培养基的组成发酵培养基的组成l水 水是培养基的主要组成成分。它既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质，而且它还直接参与许多代谢反应。 4.2.2.2 发酵培

18、养基的组成发酵培养基的组成l产物形成的诱导物、前体和促进剂 如合成青霉素g的苯乙酸，合成红霉素的丙酸等 4.2.2.2 发酵培养基的组成发酵培养基的组成摇瓶种子罐生产罐培养液细胞分离菌体培养基灭菌培养基配制培养基原料无细胞上清液产品抽提产品精制产品包装废水处理储备菌种4.2.34.2.3 发酵的一般过程发酵的一般过程 4.2 微生物发酵过程微生物发酵过程4.3 液体深层发酵液体深层发酵4.3.1 发酵的操作方式发酵的操作方式 4.3.1.1 分批发酵分批发酵 营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程。 4 发酵工程

19、发酵工程根据不同发酵类型，每批发酵需要十几个小时到几周时间。全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需时间的总和为一个发酵周期。 4.3.1.1 分批发酵分批发酵典型的分批发酵工艺流程图 4.3.1.1 分批发酵分批发酵微生物分批培养的生长曲线 1.延滞期 2.加速生长期 3.指数生长期 4.减速期 5.稳定期 6.衰亡期 4.3.1.1 分批发酵分批发酵4.3.1.2 4.3.1.2 连续发酵连续发酵 以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。 4.3.1 发酵的操作方式发酵的操作方式

20、4.3.1.3 补料分批发酵补料分批发酵 又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 4.3.1 发酵的操作方式发酵的操作方式4.3.2 发酵工艺控制发酵工艺控制 温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。 4.3 液体深层发酵液体深层发酵4.3.2.1 温度温度 p

21、h值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：影响酶的活性，当ph值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；ph值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，ph值还会影响某些霉菌的形态。 4.3.2 发酵工艺控制发酵工艺控制4.3.2.2 ph值值 对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物在进行深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会

22、造成代谢异常，产量降低。现在可采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。 4.3.2 发酵工艺控制发酵工艺控制4.3.2.3 溶解氧浓度溶解氧浓度4.3.3 发酵设备发酵设备 一个优良的发酵装置应具有严密的结构，良好的液体混和性能，较高的传质、传热速率，同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。 4.3 液体深层发酵液体深层发酵 4.3.3 发酵设备发酵设备发酵罐及其发酵罐及其控制系统控制系统l 机械搅拌式发酵罐是发酵工厂常用的类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。 4.3.3 发酵设备发酵设备4.3.3.1 机械

23、搅拌式发酵罐机械搅拌式发酵罐20122012年年5 5月月1616日自此页开始日自此页开始 4.3.3.1 机械搅拌式发酵罐机械搅拌式发酵罐l 在通风搅拌式发酵罐中，通风的目的不仅是供给微生物所需要的氧，同时还利用通入发酵罐的空气，代替搅拌器使发酵液均匀混合。 4.3.3 发酵设备发酵设备4.3.3.2 通风搅拌式发酵罐通风搅拌式发酵罐小型发酵罐l 厌氧发酵也称静止培养, 因其不需供氧, 所以设备和工艺都较好氧发酵简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。 l 酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。 4.3.3 发酵设备发酵设备4.3.3.3 厌氧发酵设

24、备厌氧发酵设备啤酒发酵罐 4.3.3.3 厌氧发酵设备厌氧发酵设备4.3.4 下游加工过程下游加工过程 l 从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。 4.3 液体深层发酵液体深层发酵双效浓缩器双效浓缩器离心机离心机结晶罐结晶罐下游加工的工艺流程 预处理发酵液高度纯化（精制）细胞碎片分离细胞破碎细胞分离 成品加工初步纯化（提取）胞外产物 4.3.4 下游加工过程下游加工过程4.4 固体发酵固体发酵 原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业中的副、废产品； 一般都是开放式的，无菌要求不高； 所需设备简单，操作容易； 劳动强度大，不便于机械化操作，微生物品种少、生长慢，产品有限

25、。 4 发酵工程发酵工程固体发酵实例固体发酵实例 例子 原料 所用微生物 蘑菇生产 麦秆、粪肥 双孢蘑菇、埃杜香菇等 泡菜 包心菜 乳酸菌 酱油 黄豆、小麦 米曲霉 大豆发酵食品 大豆 寡孢根霉 干酪 凝乳 娄格法尔特氏青霉 堆肥 混合有机材料 真菌、细菌、放线菌 花生饼素 花生饼 嗜食链孢霉 金属浸提 低级矿石 硫芽孢杆菌 有机酸 蔗糖、废糖蜜 黑曲霉 酶 麦麸等 黑曲霉 污水处理 污水成分 细菌、真菌和原生动物 4.4 固体发酵固体发酵青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。1928年为英国人fleming a.发现，20世纪40年代投入工业生产。 4.5 典型产品的发酵生产典型产品的发酵

26、生产 4 发酵工程发酵工程4.5.1 抗生素发酵生产抗生素发酵生产 目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株wis q176（一种产黄青霉，penicilliumchrysogenum）经不同改良途径得到。青霉素工业发酵生产水平已达85000 u/ml以上。 4.5.1 抗生素发酵生产抗生素发酵生产4.5.1.1 青霉素发酵生产菌株青霉素发酵生产菌株碳源：淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液 。氮源：玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼 粉或麸皮 。前体：苯乙酸或苯乙酰胺 。无机盐 ：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。 4.5.1 抗生素发酵生产抗生素发酵生产4.5.1.2 青霉素发酵生产培养基青霉素发酵生产

27、培养基4.5.1.3 青霉素青霉素发酵工艺发酵工艺冷冻管 斜面母瓶 孢子培养 25，67天 大米孢子 孢子培养 25，67天 一级种子罐 种子培养 25，4045h，12vvm 二级种子罐 种子培养 25，1315h，11.5vvm 发酵罐 发 酵 2226，110.8vvm，67天 放罐 提炼 冷至15 4.5.1 抗生素发酵生产抗生素发酵生产过滤：采用鼓式真空过滤器； 提炼：溶媒萃取法； 脱色：活性炭脱色； 结晶：丁醇共沸结晶法。 发酵后处理 4.5.1.3 青霉素发酵工艺青霉素发酵工艺l 谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种，谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型和最成熟的。l

28、谷氨酸发酵生产菌种主要有棒状杆菌属（corynebacterium）、短杆菌属（brevibacterium）、小杆菌属（microbacterium）及节杆菌属(arthrobacter)的细菌。 4.5 典型产品的发酵生产典型产品的发酵生产4.5.24.5.2 氨基酸发酵生产氨基酸发酵生产谷氨酸棒状杆菌l 谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料。l 谷氨酸提取有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述方法结合使用的方法。国内多采用的是等电点离子交换法。 4.5.2 氨基酸发酵生产氨基酸发酵生产谷氨酸钠味精l 维生素的生产多采用化学合成法，后来人们发现某些微生物可以完成维生素合成中的某些重要步骤，在此基础上，化学合成与生物转化相结