生物制药第十三章

1、动物基因工程药物动物基因工程药物一、一、动物细胞培养二、二、动物转基因技术三三 、动物反应器与动物基因（一）动物细胞培养 定义：是模拟体内生理环境，使分离的动物细胞在体外生存、增值，并维持其结构和功能的一种培养技术。基本概念组成：原代培养、传代培养、 细胞系、细胞株原代细胞：原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。传代细胞：传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细

2、胞才能继续生长，这一过程就叫传代。细胞系：细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得以一种细胞为主的、能在体外长期生存的细胞群体。细胞株：细胞株：是指从一个经生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增值形成的细胞群。动物细胞培养的基本条件一、适合的培养基一、适合的培养基原因：原因：培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增值的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的主要成分：培养基的主要成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素及其他辅助物质。氨基酸：氨基酸：是组成蛋白质的基本单位，有一部分氨基酸动物细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供糖类：糖类：是细胞生长主要能量来源

3、（葡萄糖）无机盐：无机盐：主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡动物细胞培养的基本条件优质血清目的：添加血清来补充合成细胞培养液中缺乏的细胞生长所需的多种生长因子及其他营养成分，血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，特别是对克隆细胞的生长影响明显。无菌无毒细胞培养环境1、使用层流超净工作台是最经济有效的手段；2、利用高压灭菌装置进行灭菌；3、培养液采用微滤除菌，原代采用多种消毒剂进行交叉表面杀菌；恒定的细胞生长温度和酸碱度哺乳动物的体温分布：35.5 39.5 鸟类：40 43 温度的影响：温度的影响：1、39 时人体细胞1h后就可以发现有部分细胞 受到损伤（有可能恢复）；2、40 4

4、1 培养1h后，细胞会普遍受到损伤（约半小时后可能恢复）；3、41 42 培养1h，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡；4、温度达到43 以上，培养1h细胞全部死亡.酸碱度的影响及培养范围酸碱度的影响及培养范围成纤维细胞：成纤维细胞：喜欢较高pH(7.4 7.7)传代细胞系：传代细胞系：则需要偏酸pH(7.0 7.4)培养液中常用的缓冲液：培养液中常用的缓冲液：碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2进行缓冲；例如：例如： NaHCO3加入量为2g/L，则CO2的浓度就需要调整到5%。注：在细胞培养瓶中培养，切记勿将瓶盖拧得太紧，以保证充分的气体交换。适合的气体环境主要气体有：O2、CO2。O2作用是用

5、来氧化分解糖、脂肪等碳源物质以释放其中储藏的化学能量；CO2由于培养基中的动物细胞培养已经适应了CO2的高浓度，并且CO2还可以起到缓冲的作用。动物细胞形态从细胞形态分：从细胞形态分：主要有成纤维型细胞和上皮型细胞两类。成纤成纤维型维型细胞：细胞：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。上皮型细胞：上皮型细胞：在培养皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有圆形核，细胞紧密相连单层膜样生长。哺乳动物细胞冷冻保存目的：保存种子细胞，以便随时取用是保存动物细胞的最主要目的。可以减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变，避免有限细胞系出现衰老或恶化转化，减少频

6、繁传代，降低人力和物力。影响因素1、冷冻过程要缓慢2、冷冻细胞必须处在对数生长期，活力大于90%，无微生物污染。3、细胞浓度控制在1 1075 107/ml.4、使用高浓度血清或蛋白保护剂（常采用20%血清的培养液进行细胞保存）5、使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。常用的细胞冷冻保存液（一）10%DMSO+完全细胞生长培养液（20%血清+基础培养液）。（二）10%甘油+完全细胞生长培养液（20%血清+基础培养液）动物细胞的解冻复苏目的：将冷冻保存的细胞进行解冻复苏，用于实验。注意事项:1、在操作时需戴手套，并且迅速完成；2、操作时用镊子将细胞从液氮中取出；3、解冻过

7、程需轻拿轻放；4、需待冷冻液全部融化后，才可离心出去冷冻液；5、用新鲜培养基清洗12次，以达到完全除去DMSO等冷冻剂。置于CO2培养箱37进行复苏培养。动物细胞的传代培养动物细胞的传代培养细胞生长细胞生长类型类型贴壁依赖型：来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长，只要其未转化为非贴壁依赖型的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖型：无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞，来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖型的，大多呈圆形。贴壁依赖型细胞生长特性贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期

8、，一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。贴壁主要阶段（一）游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态；（二）吸附器：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞可在24h内贴壁；（三）繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂；（四）退化期：细胞长满了载体表面，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。（二）动物转基因技术（二）动物转基因技术概念：就是通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。分类：动物细胞转基因技术、转基因动物制备技术。动物细胞转基因技术动物细胞转基因技术概念：是指通过人工方式将外源基因送入并整合到动

9、物细胞染色体中，以获得含有外源基因的动物细胞为目的的转基因技术。方法：物理法、化学法、生物学法物理法主要有：主要有：显微注射法、电穿孔法、超声波法、冻融法、基因枪法等。利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的可逆性微孔，达到增加通透性的效果，从而使外源DNA进入细胞与染色体整合。电穿孔法电穿孔法化学法主要有：磷酸钙沉淀法多聚阳离子试剂法脂质体包埋法DEAE-葡聚糖法优点：不需要昂贵的仪器设备，并且转化效率高。磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的

10、混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。脂质体包埋法首先将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液加到DNA溶液中，加热蒸发得到单层或双层带有DNA的脂质小泡，DNA包裹在脂质体膜内，可以与细胞融合，被细胞内吞，从而完成细胞的导入。生物学法概念：主要是指逆转录病毒法，是双链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的逆转录酶一RNA位模板在宿主细胞染色体中逆转录成DNA，将病毒基因组整合到寄主细胞染色体中。逆转录病毒法特点(1) 逆转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；(2) 病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；(3) 外源基因整合的拷

11、贝数一般只有一个；(4) 逆转录病毒只选择感染分裂细胞；(5) 病毒可容纳外源基因的DNA长度为8Kb。转基因动物制备技术转基因动物制备技术追溯历史：追溯历史：从1981年美国科学家戈登（Gordon）将小鼠的受精卵取出来，在显微镜下降胸甘激酶基因用玻璃管送到受精卵的雄原核，然后立刻输入假孕的输卵管中，使其在子宫内着床，最终成转基因小鼠，这就是第一列转基因动物。主要制备技术：显微注射法应用方向：小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，羊、牛、猪等基因转殖动物显微注射法显微注射法：是利用管尖极细（0.1至0.5m）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组可

12、能发生的重组、缺失、复制或易位）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。制备转基因动物的几个阶段1、目的DNA制备；2、DNA的注入原核胚；3、胚胎体外培养；4、胚胎移植（移植前鉴定）以及转基因动物的出生；5、发育和鉴定。显微注射法制备转基因小鼠的流程显微注射法优缺点比较优点：优点：1、可导入大片段的外源基因；2、外源基因的整合率较高；3、外源基因几乎分布于所有组织细胞中。缺点：缺点：1、对操作的技术人员要求高；2、获取率低，注射和移植100个小鼠胚胎，仅能获得5只转基因小鼠；3、对仪器设备要求严格，精密度要高；4、造价昂贵。胚胎干细胞概念：是一种含正常二倍体色体的具有发育全能性的细胞，胚胎干细胞法是将外源基因直接转化胚胎干细胞，经体外培养筛选后，注入表胚，再移植入受体子宫内，发育为嵌合体转基因动物。用途：可用于在细胞移植前对其进行鉴定和筛选，有利于其培养转基因动物纯合系。（三）（三） 动物反应器与动物反应器与动物基因工程药物动物基因工程药物发展前景的展望：09年，小分子化合物的市场份额约4110亿美元；而大分子生物技术药物的份额显著上升，达到1240亿美元。生物制药初期都是表达一些相对分子质量较小，结构简单的蛋白质，如胰岛素、生长激素、干扰素、集落刺激因子等。转基因动物细胞生物反应器概念：动物生物反应器是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋