泛素特异性蛋白酶USP研究进展

1、泛素特异性泛素特异性蛋白酶蛋白酶46（ubiquitin-specific protease 46, USP46）研究进展）研究进展一一.真核细胞内蛋白质的降解途径介绍真核细胞内蛋白质的降解途径介绍 溶酶体途径-非特异性的蛋白质降解系 统，真核细胞内90%以上的长寿蛋白和一部分短寿命蛋白都是在溶酶体中降解的。 泛素-蛋白酶 体途径-是真核细胞中具高效和高度选择性的特异性降解蛋白质的重要 途径，广泛参与机体多种代谢活动。 胱天蛋白酶 (caspase)途径- 蛋白酶以酶原的形式存在于正常细胞中，细胞凋亡启动后被激活。泛素泛素-蛋白酶蛋白酶体体系统系统 由泛素、泛素化酶（包括 泛素活化酶E1、泛素

2、偶联酶E2、泛素连接酶E3）、蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素化酶为底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。蛋白质的泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍 泛素是一个含76个氨基酸在结构和序列上都高度保守的蛋白质分子，分子量大概8.5kDa。 蛋白质的泛素化修饰是一种广泛存在且非常重要的蛋白质翻译后修饰。 调控许多生物学功能包括细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞免疫以及神经元退化等方面都发挥着重要作用。1.蛋白质的泛素化修饰蛋白质的泛素化修饰 是一个泛素分子(ubiquiti

3、n)通过其羧基端结合到目的蛋白赖氨酸(Lys,K)上的共价反应过程。泛素本身有7个赖氨酸残基位点，分别是K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63位，并且泛素本身的赖氨酸残基也可以再与泛素分子相互结合。二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍1.蛋白质的泛素化修饰蛋白质的泛素化修饰 首先,在E1催化下泛素的羧基端与E1的半胱氨酸激活位点以硫酯键结合,此过程需要ATP; 其次,泛素被转运到E2的半胱氨酸残基,同样是以硫酯键的形式接合; 最后,在E3的作用下,泛素的羧基端与底物蛋白的赖氨酸-氨基基团之间形成肽键从而将泛素转移到底物蛋白上。 E3具底物特异性二二.蛋白质

4、泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍1.蛋白质的泛素化蛋白质的泛素化修饰修饰步骤步骤/bst/032/0724/bst0320724f01.htm?resolution=HIGH二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质蛋白质的泛素化的泛素化修饰与衰老修饰与衰老 https:/ 去泛素化酶在维持游离泛素和泛素结合蛋白的动态平衡中发挥着重要作用。细胞内广泛存在多种去泛素化酶，按结构不同分为5种类型。包括 泛素特异性蛋白酶（USPs） 泛素羧基末端水解酶（UCHs） Machado-Joseph diseas

5、e protein domain proteases（MJDs）， 卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTUs） MPN（+）/JAMM 蛋白酶（JAMMs）泛素特异性蛋白酶（USPs）是去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类。二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍2.蛋白质蛋白质的的去去泛泛素化修饰素化修饰 二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍2.蛋白质蛋白质的的去去泛泛素化修饰素化修饰 （1）亲核体如谷胱甘肽上泛素解离（2）泛素加合到细胞内其他蛋白上（3）降解蛋白泛素寡聚体循环利用（4）未锚定泛素寡聚体的解离Alexander Y, et al. Bioc

6、himica et Biophysica Acta 2004, (1695) 189 2073.去泛去泛素素化酶化酶USP蛋白家族介绍蛋白家族介绍 二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍 含有两个短的高度保守的序列，称为Cys结构域和His结构域 序列中具有起催化作用的三联残基，即半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺，能将泛素分子从大的蛋白上移除。V. Quesada et al. Biochemical and Biophysical Research Communications , 2004,314 : 5462Multi-tissue expression of U

7、sp46 mRNA in Rattus norvegicus 3. 泛素特异性蛋白酶泛素特异性蛋白酶USP46介绍介绍 二二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质泛素化与去泛素化介绍Wei Zhang，et al. PLoS ONE, 2011,6(10),e26297.USP46调控抑郁调控抑郁usp46 为 悬 尾 试 验 （ Tail Suspension Test，TST）和强迫游泳试验（Forced Swimming Test，FST）中调节小鼠不动行为的数量性状基因。CS和B6.CSNgu1053鼠在TST和FST实验中不动时间明显更短Shigeru Tomida, et al. na

8、ture genetics, 2009,41(6): 688-695.Shigeru Tomida, et al. nature genetics, 2009,41(6): 688-695.USP46调控抑郁调控抑郁CS小鼠Usp46第92号赖氨酸缺失是造成小鼠不动时间短于C57BL/6J小鼠的主要原因CS鼠5号染色体上Usp46基因有编码一个赖氨酸的3个碱基缺失Shigeru Tomida, et al. nature genetics, 2009,41(6): 688-695.USP46调控抑郁调控抑郁细菌人工染色体Usp46转基因鼠可以逆转CS鼠的抗抑郁状态Usp46第第92号赖氨酸号赖

9、氨酸缺失导致酶活下调缺失导致酶活下调Wei Zhang, et al. PLoS ONE, 2011,6(10),e26297.USP46 基因标签基因标签 SNP 的单的单倍型倍型与与重度抑郁症重度抑郁症相关相关Fukuo Y, et al. Journal of affective disorders, 2011, 133(1-2):150-157.The deubiquitination enzyme USP46 functions as a tumor suppressor by controlling PHLPP-dependent attenuation of Akt signal

10、ing in colon cancer去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖依赖性的性的Akt信号通路而抑制结肠信号通路而抑制结肠癌症癌症读书报告：Xin Li, et al. Oncogene. 2013 January 24; 32(4): 471478.报告人：林万华时 间：2013年11月16日三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症1. 细胞细胞内内PHLPP与与USP46特异性相互作用特异性相互作用 A.HA-PHLPP1分别与USP46、USP7、USP16共转染 293

11、T细胞，USP蛋白带有Flag和HA标签，anti-Flag琼脂糖免疫共沉淀。(Flag抗体拉USP, USP拉PHLPP1，结果只有USP46拉下了PHLPP1，而USP7和USP16没有拉下PHLPP1，说明只有USP46与PHLPP1作用)。同样，只有USP46与PHLPP2相互作用。B.在DLD1细胞中，内源性的USP46可与内源性的PHLPP1、2相互作用。 293T细胞中，GST, GST-PHLPP1，GST-PHLPP2片段拉USP46，只有PHLPP蛋白的C端与USP46相互作用。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑

12、制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症1. 细胞细胞内内PHLPP与与USP46特异性相互作用特异性相互作用 D. USP46与PHLPP相互作用的最小作用区段是C端的1139-1172，PHLPP1与PHLPP2的1139-1172区段是保守的E. 同样，在PHLPP2中，也是这个保守区段1268-1301与USP46相互作用。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症1. 细胞细胞内内PHLPP与与USP46特异性相互作用特异性相互作用 Fig. 2A and 2B：在HCT116细胞中，超表达WT USP46

13、可以显著提高PHLPP的蛋白水平，其效应是减少了70%的Akt磷酸化水平。将USP46催化区段Cys突变为Ser后，突变体USP46则失去了调控PHLPP表达水平和Akt磷酸化水平能力。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症2. USP46调控调控PHLPP的表达水平的表达水平 在HCT116细胞中，野生型USP46可以上调PHLPP1的表达水平，而1139突变体和USP46-C44S没有效应(Fig. 2C)失去了磷酸化位点的PHLPP1-4A突变体，由于有抗泛素化降解作用而使其蛋白水平远远高于WT P

14、HLPP1。USP46不能进一步提高PHLPP1-4A突变体的表达水平，表明USP46通过去泛素化来提高PHLPP蛋白的表达三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症2. USP46调控调控PHLPP的表达水平的表达水平 USP46敲低后，PHLPP降解大大加快。PHLPP1和PHLPP2的半衰期分别由4.6h降为2.3h，和6.1h降为3.3h (Fig. 2F and 2G)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症2

15、. USP46调控调控PHLPP的表达水平的表达水平 体外检测，经WT USP46处理后，PHLPP1的泛素化水平下降，但USP46-C44S突变体无此效应(Fig. 3A)经MG-132(蛋白酶抑制剂) 处理后提取蛋白样品检测，发现超表达WT USP46显著下调PHLPP1的泛素化水平，而USP46-C44S突变体无此效应(Figure 3B)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症3. USP46直接直接调控调控PHLPP1的的泛素化泛素化 USP46敲低后PHLPP1的泛素化水平显著上升(Fig.

16、3C，3D)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症3. USP46直接直接调控调控PHLPP1的的泛素化泛素化 当仅超表达PHLPP1时，Akt的去磷酸化水随PHLPP1的表达增加而下调。然而，Akt的去磷酸化程度很低(Fig. 4A, lanes 1-4)。共表达USP46和PHLPP1可以很显著地下调PHLPP1作用的Akt去磷酸化，因为USP46可以稳定PHLPP1蛋白水平(Fig. 4A,lanes 5-6)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信

17、号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症4. USP46 可以增强可以增强PHLPP的的Akt 去磷酸化去磷酸化能力能力 在测定PHLPP1 和USP46基因对HCT116细胞增殖的影响时，我们发现Akt的磷酸化水平与细胞增殖速率密切相关(Fig. 4B)。超表达PHLPP1可以剂量性的抑制细胞增殖，USP46共表达则可以增强这个效应(Fig. 4B)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症4. USP46 可以增强可以增强PHLPP的的Akt 去磷酸化去磷酸化能力能力,抑抑制细胞增殖制细胞增殖敲低US

18、P46可以提高Akt的磷酸化水平，敲低USP46后WT PHLPP1的Akt去磷酸化能力大大下降，而抗泛素化的PHLPP1-4A的Akt去磷酸化能力不变(Fig. 4C)。在敲低USP46的细胞内，PHLPP1很难抑制细胞增殖(Fig. 4D)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症4. USP46 可以增强可以增强PHLPP的的Akt 去磷酸化去磷酸化能力能力,抑抑制细胞增殖制细胞增殖 构建 载体、USP46、PHLPP1、及共表达PHLPP1和 USP46 4种HCT116细胞稳定株。将细胞株注射入裸

19、鼠皮下，观察其后32天的成瘤性。如图A所示，参照组细胞能有效的成瘤，到实验结束时瘤体积达到1600mm3，超表达USP46后瘤体积明显减小，但差异不显著。而超表达PHLPP1则显著减小瘤体积。共表达USP46则可显著提高PHLPP1的抑瘤能力。可从分离的瘤内检测到PHLPP1和USP46的表达。在超表达USP46的细胞中PHLPP1的表达增加，而Akt磷酸化水平下降(Fig. 5B)。三三.去泛素化酶去泛素化酶USP46通过控制通过控制PHLPP依赖性的依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症信号通路而抑制结肠癌症5. USP46增强增强PHLPP1肿瘤抑制能力肿瘤抑制能力以Ki67免疫染色了肿瘤组织，发现超表达USP46,