荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及...

1、第26卷第6期2007年12月Vo卜26No62007-12电子显微学报Journal of Cliiiiese Electron Microscopy Society:10006281 （2007）06-062005荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展张志毅.周 涛，巩伟丽.张德添（国家生物医学分析中心北京100850）:荧光共撮能重转移（FRET）是指两个荧光基团间能重通过偶极偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给 受体的现象冋被用于測定分子间的距离。FRET荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镉系染料和量子点近 年来有许多新的应用:测试方法上与时间分辨、单分子检測、荧光寿命和

2、荧光相关光憎竽技术联用取得了更好的 成效。:荧光共掾能重转移:荧光探针单分子检測;荧光相关光谱© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No62007-12© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No620

3、07-12:TG115.21°5.7:TG15.3°3:Q331 :Q336蛋白质相互作用是当前生命科学研究的重大课 题而荧光共振能量转移（nuorescence rcsonuce energy tmnjfcr .FRET）技术是目前研究蛋白质相互作 用比较成熟、已被广泛应用的几种方法之一。与其 他几种方法如免疫共沉淀、酵母双杂交及质谱等技 术相比.FRET方法的特点是适用于活细胞和固定细 胞的各类分子灵敏度和分辨率高并能清晰成像 最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息. 因而受到广泛重视。近年来有关文献层出不穷。本 文在介绍FRET原理的基础上简要回顾了近两年来 FR

4、ET方法的应用研究与进展。1 FRET1.1物质在吸收入射光的过程中，物质分子吸收了 光子的能量在约10，5 s时间内其电子从低能 级的基态跃迁到较高能级的激发态根据其电子是 否全部自旋配对激发态可分为单重态和三重态21 0 处于激发态的分子不稳定它可能通过辐射跃迁和 非辐射跃迁的衰变而返回到基态。辐射跃迁的衰变 伴随着光子的发射即产生荧光和磷光。由于非辐 射能量损失，发射光子的能量一般小于吸收光子的 能量故而荧光物质的发射光谱波长要大于吸收光 谱波长。1.2如果两个荧光团相距在Iio nm之间-且一个 荧光团（供体）的发射光谱与另一个荧光团（受体）的 吸收光谱有重叠，当供体被入射光激发时可通

5、过偶 极偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受 体分子供体分子衰变到基态而不发射荧光受体分 子由基态跃迁到激发态再衰变到基态同时发射荧 光。这一过程称为荧光共振能量转移（fluoresceiKe resonaiKe energy tranjfer .FRED 01.3 Forster荧光共振能量转移其实包含两种主要机制。一 种指的是供体单重态与受体单重态之间的共振能量 转移，其机制最早由Forster阐明引，因此被称为 Forster 共振能 量转移（Forster resonance energy transfer）,由于其缩写也是FRET.且甩stci共振能量 转移是荧光共振能量转移的最

6、主要机制.故这两个 概念易被混淆。另一种机制是供体三重态与受体单 重态之间的共振能量其机制被称为德克斯特电子 传递机制。但其有效范围在1-0 nm1.5 nm'5'. 就发生概率而言10 nm的距离中.Rkster共振能 量转移是主要途径目前文献中的“FRET” 其含义 多是用"Forster共振能量转移”指代了啖光共振能 量转移” 本文中也沿用了这一习惯。Raster推导出这个过程的效率依赖于供体和受 体间距离六次幕的倒数：E = 1/1 + （r/?o）6（1）其中&称为Foster半径是指能量传递效率 为50 %时，供体与受体之间的距离。其依赖于染料 的

7、光谱特性及它们的相对方向.对干特定的体系和 能量供受体对可以将&看作恒量：厂为供体与受© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No62007-12© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No620

8、07-12:2007-05-24:张志毅（1977）男（汉族）山西省太原人助理研究员.© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No62007-12© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第26卷第6期2007年12月Vo卜26No62007-1

9、2© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. AU rights reseixed. http:/m h 第6期张志毅竽：荧光共撮能量转移技术左生命科学中的应用及研究进展623是:总量转移应当在远大于碰撞半径的距离上发体之间的距离.Styrer和Haugland给出:E = 1 /da/dH和/D分别是有受体和无受体时供体的荧光强 度这样通过测量供体的荧光强度可以算出£。心的实验值（单位A）可通过下式计算:'3 XI 000"-4 NAl/2r其中JA|i/2表示当供体溶液

10、的荧光有50%被 猝灭时受体的浓度內O求出E和心代入（1）式就可以得出供体与受 体之间的距离厂从而判断它们之间是否发生相互 作用。分子间的能量转移机制并非只有共振能量转移 一种。判断共振能量转移过程的两个最重耍的标准 生：（2能量转移效率与介质的黏度变化无关山o2 FRETFRET探针即共振能量转移的供受体对.主要分 为以下几类:荧光蛋白，有机荧光染料铜系染料和 量子点。2. 1荧光蛋白的应用源于绿色荧光蛋白（green fluorescence p mt ein .GFP）的发现因其可标签几乎所 有蛋白以及支持活体实时检测因而得到迅速普及0 由GFP相继又获得了一系列突变体荧光蛋白如蓝 色荧

11、光蛋白（BFP）、青色荧光彊白（CFP）、堇色荧光 蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。由于这些 荧光蛋白的吸收光谱和发射光基本连续相邻.因而 为FRET实验提供了可选的供受体对。其中CFP和 YFP是目前最常用的荧光蛋白供受体对。卜鹏程等分别构建了 CD146与CFP和YFP的 融合基因并共转入细胞通过FRET的増强来检測 8146的二聚化体的形成Sarah等利用増强型 的ECFP和YFP作供受体对.构建了 SUMO化的原 核表达检测系统2 .通过FRET的减弱来观察SUMO 化的发生。Michael运用CFP与YFP间的FRET増 强来观测P©磷酸化作用后底物构像的改变o由

12、于CFP和YFP的发射光谱有较大程度的重 叠因而増加了串色导致假阳性的可能性（。 Mizum和Bevis等的研究表明GFP的变种GFP和 DsRED的变种DsRED2可提供一对较好的供受 体,，5J61 o Yuch- Yng Hsu 利用 GFP2 和 DsRED2 作FRET探针建立了肠道病毒蛋白酶作用的检测方 法“ O2.2有机荧光染料种类繁多.应用广泛可根据需要 选择适合的染料并可以和其它类探针配对使用。 Antia等通过Alexa488/Alexa594标记纤维素结合蛋 白的半胱氨酸残基.证明了纤维素结合蛋白的构象 有利于其形成二聚体切o Breunig等用OY>1标 记DNA

13、.用1AMRA标记核蛋白多聚体通过FRET 实验检测了核蛋白多聚体的稳定性剧o2-3属于稀土元素.常与传统的有机染料联用，分别 作为FRET的供体和受体。铜系染料的优势在于: 与传统FRET染料相比.其准确性和信噪比大大 提高：它们对不完全标记的供体和受体样品不敏 感z o最常用的輛系元素有彩（Sm）、铸（Eu）、钛 （lb）和備（Dy） oRcga等为研究Bcl-X.和BH3相互作用.分别用 Hirtag和生物素标记两者.再用各自的抗体分别标 记Hrtag和生物素.最后用铸染料标记Hisrtag的抗 体.用APC（异薄蓝蛋白）标记生物素的抗体.通过 TRFRET （lime-resolved

14、 fluorescence resonance energy tranrfer）检測到了铸与APC之间的荧光共振能量转 移.从而判断Bcl-X.和BH3之间存在相互作用'汕o量子点是一种直径在1100 nm之间,能够接 受激发光产牛荧光的纳米颗粒。其特点是：激发 波长范围很宽；发射光谱也很宽.单个量子点的荧 光谱峰狭窄而对称；（珂以通过改变量子点的大小 来调节量子点的发射光谱与受体分子吸收光谱的重 叠程度：量子点发射荧光是有机荧光染料的发射 光强的20倍.稳定性强100倍以上3 o由于以上优点量子点作为一种新型的荧光探 针正越来越广泛地被采用。Quande Wei等利用量子 点QD 5

15、65标记雌激素受体B （ERB ）的单克隆抗体 用有机荧光染料Alexa Huor（AF）标记日祁 的多克 隆抗体而后通过QD 565与AF间的FRET检测求 得探针间的距离为89 nmir, o3 FRET新探针的发现可以推广或深化FRET的应用范 H 一些新的测试分析方法则为提高FRET技术的 灵敏度和分辨率起到重要推动作用。3. 1FRET( time resolution FRET, TRFRET)时间分辨FRET主要利用了一些分子(如輛系 元素)的荧光寿命长(激发后发射时间长于普通荧 光)的特点选取生物样甜自发荧光已经熄灭而长荧 光寿命分子团还在发射的时间段检测就会大大降 低背景噪声

16、提高信噪比。对于检测荧光分子流动 性、提高灵敏度、高通量检测和降低假阳性率都起到 显蓍作用oCbwda等为研究雌激素耦联受体B (ERRP)与雌 激素类复合物结合时共调控子的作用用GST(谷胱 昔肽S转移酶)标记ERRB的配体结合域，再用轼标 签的C8T抗体相结合作为能量供体，用荧光素标记 的从共调控子获取的活性序列肽段作为能量受体, 通过 WFRET筛选出了共激活子的LXXLL iwtif序 列共阻遏子的LXXI/HIXXXI/L nptif序列以及其它 相互作用nntif序列凶。3.2 FRET所谓单分子FRET就是将单分子荧光检测与 FRET技术相结合的方法。单分子荧光检測是指对 单个分

17、子的荧光特性进行检测。因为几乎所有的分 子生物学实验结果只代表测量时间内大量分子的平 均行为而生物体系一般来说都是不均匀体系尤其 对于生物大分子而言。因此监测单个生物大分 子的行为具有重要意义。目前单分子探测主要是通 过以下步骤实现：小的激发体积以削减背景噪 咅；高效的集光光学元件：Q高量子效率和低暗电 流的探测器：W用各种方法减小噪音再。Wshiyuki等为了研究Ras与多种效应器发生相 互作用的机制，用Cy3标记Ras的Switch II区，用 Cy5标记GTP.通过His单克隆抗体吸附在载玻片 上进行单分子FRET检测。通过FRET效率显示 出.Ras构象在多种状态间变化切o3.3 (F

18、RET*FL IM)FRET方法能够给出nm量级的空间分辨率但 却无法给出瞬间的时间分辨信息。而荧光寿命成像 (fluorescence lii'clinvresolved imaging)技术则 可以计 算出细胞内不同区域的荧光寿命分布从而给出荧 光寿命像。FKEFFLIM技术是将荧光寿命成像用于 FRET实验中通过比较在受体有和无情况下供体的 荧光寿命的变化可以确定供受体间是否发生了共 振能量转移0Creniazy等分别用荧光染料Sytox Orange和绿色荧光蛋白 曲进行标记并运用FRETR.M技术在 原位检测到DNA和组蛋白H2B相互作用国o3.4 FRET( FCS- FR

19、ET)荧光相关 1W (fluorcsccncc correlation spectroscopy . FCS)技术的特点在于利用从某种程度上反映分子 荧光发射物理参数的细微瞬时涨落.通过对其引起 荧光涨落信号的时间变化函数作分析推导出支配 分子动态性过程的分子浓度、化学动力学参数等必 要信息oFRET与FCS联用可以提高其检测灵敏度c Remaut等用罗丹明绿和分别标记寡核昔酸的丁 端和亍端.通过罗丹明绿和Cy5之间的荧光共振能 量转移来监测细胞内寡核昔酸的降解。与FCS的 配合.使得单用FRET无法检测的微量寡核昔酸发 出的低强度荧光能够被观察到汕0除了以上FRET技术扩展应用外.FRET

20、还可以 和其它设备如停流仪(Stopped-flow instruments)等联 用必为提高FRET的检测灵敏度发挥积极作用。4 FRET还有一些工作是针对FRET技术的可靠性验证 而展开的。Sugawa等用05标记DNA 5端，用1MR标记 DNA上每相隔一定数量碱基对的多个胸腺嗜喘.通 过单分子FRET效率的差异计算出的胸腺嚅旋距离 符合从DNA理论结构计算得出的值。从而验证了 单分子FRET方法的可靠性3。Christina等讨论了 FRET实验可能遇到的问题. 如:激发光串扰发射光串色，非特异FRET等还绐 出了多种情况下的FRET定量方法冋o5 FRETFRET最基本的原理是通过易

21、于检測的荧光共 振能量转移的效率信息来反映两分子团的距离信 息而距离接近到10 nm之间是两分于相互作用或 一个分子的两个结构域因构象改变而相互靠近的有 力证据。通过FRET效率的增强可检测分子间发生 相互作用或构象改变而靠近;FRET效率的减弱可用 于证明两分子远离因而失去相互作用或证明一个 分子的两个部分间因分子被切断或构象改变而相互 远离。理论上.在分子水平上研究任何生物学机制都 可以运用FRET技术关键在于找到合适的荧光探 针和检测设备。事实上FRET方法的应用领域非常 广泛。近两年来的文献中在核蛋白机制，细胞外基 质.生物膜功能信号转导，细胞凋亡，细胞骨架生 物材料等多个方向领域都可

22、以找到FRET技术的应 用案例。FRET技术无疑已成为细胞分子机制研究 的重要工具。6大约60年前.由Foster阐明了单重态单重态 荧光共振能量转移机制。几年后&0之利用这一机 制为大分子的微观测距打造了一把髙精度“纳米 尺” 突破了传统光学方法的极限是量子力学应用 的一个成功例子。大约20年前绿色荧光蛋白的发 现揭开了 FRET应用的新篇章。微观量子的复杂性使我们从分子力学的角度解 释生命现象遇到重重困难的同时，又为新现象的不 断发现提供了无限可能。当前FRET技术努力解决 的问题是如何减少和排除非特异信号以及提高对极 低水平倍号的探测。在发光源、髙级成像技术和理 论分析模型等领域

23、的创新是推动FRET发展的巨大 牵引。同时许多新的技术如BRET.LRET等也相继 问世冋。今后随着各领域方法技术的日益交汇融 合.以及新仪器的层出涌现生命科学的分析测试能 力将不断増强为生命科学研究提供日益精尖的工 具。1 Didenko V V Fluoresccnl Energy Trantfer Nucleic Acid ftobesM|. New Jersey: Humana Press Inc ,2006(2 许金钩.王尊本.荧光分析法M.北京：科学出版 社.2006. 72 76.3 Rrste T. Intrannlecular energy migration and fli

24、nrescence J. Ann Phys J948 .2:55.| 4 BxlcrDL A lheory of sensitized luminescence in solid J. J Chem Phy.l953 .21 (5) :836 850.5堀辽一之.等普.张镇西译分子光子学|M.北京: 科学出版社.20(M. 109.6 Str)vr L Haugland R P. Fluorescence energy tranter: a jpectioscopic ruler fJ. PNAS.1967.58 (2) :719 726.| 7 Heim R ftasher D C Tsie

25、n R Y. Wavelength mutations and posttninslatioiial auloxidation d' green flu)rescent plutein J. PNAS J994.91 (26) : 12501 12504| 8 | Heim R laen R Y bnneenng green fluorescent protein for linpioved brightness .longer wavelengths and fluorescence rcs)nance erergy tranter J . Curr Biol .1996 .6 (2

26、) :178 182| 9 Lewis J C, Dauiiert S Dual detection cf peptides in a ilinrescence binding assay by enplojing genetically fused CFP and BFP mutantsJ . Anal Chem .1999 .71 (19) :432l 4327(10 J Nfizuix) H , Sawano A , Eli P.et al Red fluorescent protein from Disoosonia as a fusion tag and a partner for

27、fluorescence resonance energy tranter J Biochemistry 2001 .40(8) :2502 - 2510.11 Bu P C .Zhuang J , Feng J ,ct al. Visualization of CD146 dimerization and its regulation in living cells|J Biocliinica et Biophysica Acta ,2(X)7 .1773 :513 - 520.12 Martin S F Neil H A Samuel D W. cl al. A fluorescence

28、resonance energy (ranker based piolcase actixity assay and its use to nnnitor paraJog卑eciWc small ubiquitiirlike nwdiWcr piuccssing |J . Analstical Bioclienistry 2007 . 363:83- 90.13 Allen M D 2iang J. SubcelluJar dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET based reporters J . Biochemic

29、al and Biophysical Research Q)nununicalions. 2006 .348:716 721 14 Ginesan S. Meer Beg S M, Ng T T Vojnovic B . buters F S A dark yellow fluorescent piotcin ( YFP)-based Resonance Energy Accepting ChiunppiDtein (REACh) for fbrster resonance energy tranter with GFP |J |. PNAS. 2006 .103:4089 - 4094.15

30、 Nfizuno H . Sawano A t Hi P, Haina H Nfiyawaki A Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy tranter J Biochemistry .2001 .40:25O2 2510.16 Bevis B J Qick B S Rapidly maturing variants of theDisormma red Hmreent pmtein (rkReci)| J . NntBiote

31、chrol .2002 20:83 - 87.17 Antia M Idas L D Boness D A . et al. Single nplecule florescence studies of surface adsorbed fibfunectin J Bioimtcrials 2006 .27 :679 690.18 Miriam B . Uta L Liebl R et al. Huorescence resonance energy tranter: Evaluation of the iiMracellular sta&lily of pol)plexes (J E

32、uwpean Journal of Phamiaceutics and Biopharmacculics .2006 .30:156 165.1191孙学刚.张朋华姜勇.FRET的理论基础及应用J 中国病理生理杂志.2004 .20:1721 - 1724.20 Rcga M F. Reed J C. Mleccliia M Robust lanthanide- based assays for the detection of anti-apoptotic BcF2-fanily protein anlag)nists J Bioorganic Chemistry 2007 .35 :113

33、 120.21 孟爲.宋增璇.复子点在生物医学中的应用J生 物化学与生物物理进展.2004.31(2) :185187.22 Wei Q D , Lee M, Yu X B cl al EtevelopimM of an open sandwich fluoroimnMinDassay based on fluorescence resonance energy tranter | J Anal>tical Biochemistry 2006.358:31 37.23 Niithis G Rare earth cQptates and homogeneous fluotoininr un

34、oasays with human sera J |. Gin Chem. 1993.39: 1953.24 Cbwda K. Envelopment of a ooactistor dijplacemenl assay for lhe orphan receptor estrogeirrelated receplo厂c using time revived fluorescence resonaiKe energy tranter J Anal>tical Biochemistry .2006 .357 : 105 - 11525 林克椿.生物单分子研究的进展J.生物物理学报. 200

35、1 J7(3) :411 418.26 王桂英王琛.等.生物单分于光学探测方法的进展 J.激光生物学报.20032(3) :174 - 178.| 27 Arai Y. D>nanic polyiwiphism Ras observed by single nulecule FRET is the basis for nulecular recognition J Biochemical and Biophysical Research G)nYnunicat>ons 2006.343:809 815.1281郑东.荧光共振能重转移及其新进展|J.新技术应 用.2003 J :43

36、 46.|29 Fredenc Geinazy G E Erik Mandersa M M. Philippe Bastiaens 1 H, et al. Imaging in situ pixXeiirDNA interactions in lhe cell nucleus using FRETH-IN1 | J Experimental Cell Research .2005 309 :390 396.30 陈同生邢达荧光相关谱技术及其应用|J激光生 物学报.2005,14(1) :69 - 75.31 Reimut K.et al. FREPFCS as a tool to evalua

37、te the stability of oligonucleotide drugs after intracellular delivery J . J Cbntful Release .2005 .103(1) :259 271.32 linis H S Widom J , et al Stoppcd-tlow fluorescence resonance energy transfer for analysis of nucleos)me dynaiiics|J . Methods .2007 ,41 :296 - 303.33 Sugauu M, Arai Y. hvanc A H. c

38、l al Single molecule FRET for the study on structural dynamics of bionnlecules J . BioSystems ,2007 .88:243 250.34 lakanishi C L , Bykova E A , Cheng W. el al GFR based FRET analysis in live cells J . Brain research . 2006 . 1091 :132 139.35 Jares-Erijnun EA. Jovin T M Imaging nnlecular interactions in living cells by FRET niciosoopyJ Curren