发酵与酶工程第一章

1、第一章：第一章：工业微生物菌株工业微生物菌株 q微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求q一些工业化产品生产菌种的特点一些工业化产品生产菌种的特点q自然界中有目的微生物分离的原则自然界中有目的微生物分离的原则q菌种选育、分子育种菌种选育、分子育种q 有些微生物能在厌氧的条件下生长有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能利用简单的有机物、无机物满足自身的生长有些微生物能利用简单的有机物、无机物满足自身的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长有些微生物能

2、在极端的环境下生长一、微生物的特性一、微生物的特性二、工业化菌种的要求二、工业化菌种的要求 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操性要强性要强 遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体不易感染它种微生物或噬菌体 生产特性要符合工艺要求生产特性要符合工艺要求 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）无关）三、工业微生物的分离与筛选三、

3、工业微生物的分离与筛选工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株；二是把分离到的野生型菌株进一步界分离所需要的菌株；二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。纯化并进行代谢产物鉴别。（1 1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2 2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。进行分离筛选。（3 3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋）从一些发酵制品中分离目的菌株，如

4、从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。采样时要注意的问题采样时要注意的问题l 根据土壤特点：根据土壤特点：5-25cm; 5-10cm(酵母酵母); 10-30cm(北方地区北方地区)l 结合微生物的生理特点结合微生物的生理特点l 特殊环境下的采样特殊环境下的采样l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等采样采样控制培养基的营养成分控制培养

5、基的营养成分 富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。控制培养条件控制培养条件 抑制不需要的菌类抑制不需要的菌类 富集富集富集培养主要根据微生物的碳、氮源、富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pHpH、温度、需氧等、温度、需氧等生理因素加以控制。生理因素加以控制。 分离分离 稀释涂布法：稀释涂布法： 划线分离法：划线分离法： 利用平皿的生化反应进行分离：利用平皿的生化反应进行分离： 透明圈法透明圈法 变色圈法变色圈法 生长圈法生长圈法 抑菌圈法抑菌圈法 组织分离法：组织分离法： 单细胞或单孢子分离法：单细胞或单孢子分离法：

6、实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）80、30 min处理处理文献文献: :产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌菌及霉菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型目的目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防

7、止菌种退化四、菌株选育、分子改造四、菌株选育、分子改造方法方法基因突变：基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：基因的直接进化：点突变、易错点突变、易错PCRPCR、DNA ShufflingDNA Shuffling等等合成生物学合成生物学自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为1010-8-81010-9-9自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降

8、，这种突变成为负突变生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。成为正突变。（一）自然选育（一）自然选育自然选育在工业生产上的意义？自然选育在工业生产上的意义？极端微生物极端微生物？自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。重要措施。回复突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回

9、复突变突变问题：问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞( (孢子孢子) )悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验（二）诱变育种（二）诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变

10、剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍航天育种：高真空，微重力，强辐射航天育种：高真空，微重力，强辐射2. 诱变剂处理过程中几个有关的问题诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择1. 诱变剂的作用原理诱变剂的作用原理3 3 诱诱 变变 育育 种种 的的 一一 般般 步步 骤骤4. 筛选的方法筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如从产物形成

11、的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记称为遗传标记结构类似物结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。 HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转

12、乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：LysLys的类似物的类似物AEC,ThrAEC,Thr的类似物的类似物AHVAHV营养缺陷型营养缺陷型：如如ThrThr缺陷型缺陷型黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l（三）（三） 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育（1 1）噬菌体的分布）噬菌体的分布（2 2）抗噬菌

13、体的选育）抗噬菌体的选育 自然突变自然突变 诱发突变诱发突变（3 3）抗噬菌体菌株的特性试验）抗噬菌体菌株的特性试验 抗噬菌体性状的稳定性试验抗噬菌体性状的稳定性试验 抗噬菌体的产量试验抗噬菌体的产量试验 真正抗性与溶源性的区别试验真正抗性与溶源性的区别试验（4 4）噬菌体的防治）噬菌体的防治 正确判断：畸形菌丝、菌体消失、正确判断：畸形菌丝、菌体消失、pH上升、发酵产物上升、发酵产物 停停止积累、产物下降止积累、产物下降 普及有关噬菌体的知识：噬菌斑普及有关噬菌体的知识：噬菌斑 选育抗噬菌体菌株选育抗噬菌体菌株 消灭噬菌体：漂白粉、甲醛、石灰水消灭噬菌体：漂白粉、甲醛、石灰水 收集和保存噬菌

14、体收集和保存噬菌体（四）杂交育种（四）杂交育种杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。细菌的杂交：细菌的杂交：放线菌的杂交：放线菌的杂交：异核现象；接合现象；异核系的形成；重组体异核现象；接合现象；异核系的形成；重组体 的形成的形成霉菌的杂交育种：霉菌的杂交育种：异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组原生质体融合：原生质体融合：（五）基因的直接进化（五）基因的直接进化(directed ev

15、olution)q 突变突变 基因突变库的建立，宏基因组基因突变库的建立，宏基因组q 筛选筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传基因复制与遗传步骤步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。主要应用：主要应用：酶学性能的提高酶学性能的提高: :l pHpHl 温度温度l 有机溶剂有机溶剂生理环境生理环境工业催化环境工业催化环境l 底物专一性底物专一性脂酶拆分脂酶拆分2-2-甲基癸酸硝基苯酯甲基癸酸硝基苯酯例：例：PLAPLAPLA光学拆分选择性光学拆分选

16、择性(%)(%)2 31 57 75 81 905 5次错位次错位PCR 2PCR 2次定点突变次定点突变Reetz (1997) Liebeton(2000) Reetz (1997) Liebeton(2000) 定点突变定点突变DNA Shuffling:指指DNA分子的体外重排，是基因在分子水分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组平上进行有性重组(Sexual Recombination)。项目项目进化速度进化速度进化对象进化对象进化进化周期周期影响对象影响对象突变效率突变效率常规定向进化常规定向进化缓慢进化缓慢进化整个基因组整个基因组多年多年完整基因组完整基因组低低DNASh

17、uffling快速进化快速进化特定基因特定基因/ /操纵子操纵子/ /病毒病毒几天几天部分基因组部分基因组高高DNA Shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较类类 型型示示 例例特特 性性活性增加倍活性增加倍数数潜在应用领潜在应用领域域抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性10，000生物制药生物制药-内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性32，000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E耐热性耐热性65耐热时间耐热时间17200工业酶工业酶细胞因子细胞因子人类干扰素人类干扰素抗病毒抗病毒285，00

18、0基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P5337半衰期半衰期12基因治疗基因治疗代谢途径代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒40生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒12生物制药生物制药部分部分DNA Shuffling技术的研究成果技术的研究成果菌种改良的新策略 核糖体工程核糖体工程：以胞内最主要的两以胞内最主要的两个细胞器即核糖体和个细胞器即核糖体和RNA多聚酶为对多聚酶为对象，以引入的抗生素抗性突变为外在表征，定向筛选次生代谢产象，以引入的抗生素抗性突变为外在表征，定向筛选次生代谢产物合成物合成能力提高的突变菌株。能力提高的突变菌株。 常用于抗性筛选的抗

19、生素主要包括链霉素、利福平、硫链丝菌素、夫西常用于抗性筛选的抗生素主要包括链霉素、利福平、硫链丝菌素、夫西 地酸、庆大霉素、巴龙霉素、林肯霉素、遗传霉素等。地酸、庆大霉素、巴龙霉素、林肯霉素、遗传霉素等。 应用成果：抗生素产量提高；提高淀粉酶及蛋白酶的产量；应用成果：抗生素产量提高；提高淀粉酶及蛋白酶的产量；提高有机溶剂的耐受性提高有机溶剂的耐受性 Ochi K. From microbial di fferentiation to ribos ome engineering. Bioscience , Biotechnology , and Biochemistry, 2007, 71 (6

20、) : 1373 - 1386. 表观遗传修饰表观遗传修饰：激活沉默生物合成基因簇激活沉默生物合成基因簇, ,寻找新寻找新型小分子化合物的有效手段。型小分子化合物的有效手段。 组蛋白的组蛋白的(去去)乙酰化和乙酰化和 DNA 的的(去去)甲基化甲基化Shwab EK, Bok JW, Tribus M, et al. Histone deacetylase activity regulates chemical diversity in Aspergillus. Eukaryot Cell, 2007, 6(9): 16561664. 应用成果：采用表观遗传学试剂对真菌进行遗传选育应用成果：采用表观遗传学试剂对真菌进行遗传选育, 包括包括曲霉属、青霉属、担子菌等在内的曲霉属、青霉属、担子菌等在内的 12 种真菌都产生了一定的种真菌都产生了一定的新代谢产物新代谢产物, 其中一些菌种的已知代谢产物的产量也得到了其中一些菌种的已知代谢产物的产量也得到了提高。提高。 全局转录调控全局转录调控gTME（global transcription machinery engineering）：）： 整体水平上改变细胞基因组转录，获得有益细胞表型的一种整体水平上改变细胞基因组转录