脊髓背角PKC在炎性疼痛中的作用及其机制

1、脊髓背角PKC在慢性炎性疼痛中的作用及其机制索占伟基金项目：国家自然科学基金资助项目（No. 30870837；No. 81072626）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”（No. NCET-08-0259）；兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（No. 860330）作者简介：索占伟（1978-），男，博士，讲师，科研方向：慢性疼痛的中枢发生机制，E- mail: suozhw.*胡晓东（1972-），男，博士，教授，研究方向：慢性疼痛的中枢发生机制，通讯作者，TelFax: E- mail: huxxiaodong. 杨娴

2、曹静 刘燕妮 时蕾 李帅 杨鸿斌 胡晓东*（兰州大学药学院分子药理研究所，兰州 730000）摘要： 目的 探讨蛋白激酶C ( Protein kinase C；PKC ) 的抑制剂和阻断剂对痛觉超敏的影响及其分子机制。方法 小鼠后趾皮下注射完全弗氏佐剂( Complete Freunds Adjuvant; CFA )建立炎性疼痛模型；鞘内给予PKC抑制剂白屈菜赤碱（Chelerythrine；CHE）或激动剂 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 前后，测定小鼠缩足阈值；随后立即分离脊髓背角，免疫印迹法检测NMDA ( N-methyl-D-aspar

3、tate ) 型谷氨酸受体的突触表达。结果 PKC抑制剂CHE在缓解炎性痛觉超敏的同时，明显翻转脊髓DMNA受体NR2B亚基的突触表达亢进；而正常小鼠鞘内给予PKC激动剂PMA，可模拟CFA的效应，即：诱发痛觉超敏、并特异性增加NR2B的突触含量。结论 PKC通过调节脊髓NMDA受体NR2B的突触表达，参与炎性疼痛的形成。关键词：蛋白激酶C; Chelerythrine; PMA; 炎性疼痛; NMDA受体脊髓背角是痛觉信息传递与调控的第一站。初级传入纤维通过兴奋性谷氨酸能突触传递，将伤害性或非伤害性刺激从外周向中枢输送。在脊髓背角表达的三种兴奋性谷氨酸能受体中，NMDA受体的功能异常升高，被

4、认为在慢性疼痛的形成和维持中发挥核心作用。而脊髓背角中的NMDA受体主要是由2个功能性NR1亚基和2个调节性NR2A或2个NR2B亚基所组成的四聚体。进一步的深入研究显示1：炎性疼痛能够特异性提高脊髓背角中“包含NR2B亚基的NMDA受体(简称NR2BR)”的突触表达；当特异性阻断NR2BR后，组织或神经损伤诱发的痛觉超敏和痛觉过敏会被完全取消2，提示：NR2BR的突触表达亢进在慢性疼痛中的作用尤为关键。而深入探讨NR2BR表达的分子调控机制，对揭示慢性疼痛的中枢发生机制和探寻新的药物镇痛靶点都具有重要意义。现已知，NMDA受体的突触表达受一系列蛋白激酶的调控。蛋白激酶C ( Protein

5、kinase C；PKC )是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，在突触传递和突触可塑性过程中发挥重要作用。资料显示：活化的PKC可取消Mg2+对NMDA受体的阻断，增强受体通道的开放 3；此外，PKC也能够通过磷酸化NR1亚基胞浆C-末端的S-890、S-896等多个丝氨酸位点4，显著增强NMDA受体的功能。但PKC是否能够干预NMDA受体的突触表达、并参与慢性疼痛过程，到目前为止尚不清楚。为探讨PKC对NMDA受体突触功能的调节作用及其与炎性疼痛的关系，本研究利用PKC抑制剂CHE和激动剂PMA，观察PKC对炎性痛觉超敏的影响，并通过免疫印迹法检测PKC对脊髓背角NMDA受体亚基突触表达的调节作

6、用，探讨其参与痛觉调制的分子机制。1 材料和方法1.1 动物 昆明种成年小鼠（, 2022g），由兰州大学实验动物中心提供。1.2 试剂 Chelerythrine（CHE；Sigma）；Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA；Sigma)；完全弗氏佐剂（Complete Freunds Adjuvant, CFA; Sigma）；特异性NR2B、NR2A抗体（Millipore Corporation, Temecula, CA, USA）；辣根过氧化物（HRP）标记二抗（Jackson Immuno Research Laboratories, Balti

7、more, PA, USA）；-Actin抗体、ECL发光试剂盒（江苏碧云天）。1.3 疼痛模型制备及行为学测试 对照组小鼠皮下注射20l生理盐水，模型组右后趾皮下注射等量CFA。模型制备前后，采用Up-Down法1 测定Von Frey纤维诱发的缩足阈值（PWT）。1.4 鞘内给药 采用微量注射法5。动物经苯巴比妥钠（30mgkg-1）肌注麻醉后，用25l 微量注射器于L5-L6椎间隙经皮穿刺，以进针产生空洞感、动物甩尾作为针头进入蛛网膜下腔为标志。进针后缓慢注射药物5l，对照组注射同等体积的生理盐水。1.5 亚细胞结构分离 鞘内给药20min后，经苯巴比妥钠麻醉，施行锥形板切开术，分离L4

8、-L5节段脊髓，在4细胞裂解缓冲液中进行匀浆1。匀浆液通过梯度离心，提取得到富含突触后密致（PSD）的亚细胞结构，具体步骤为：1000×g离心匀浆液10min，取上清（S1）；S1经10 000×g离心，收集富含突触小体(Crudesyntosomal fractions)的沉淀P2；P2用含0.5%Triton X-100的细胞缓冲液裂解15min后，32 000×g离心20min，得到富含突触PSD的亚细胞结构的沉淀P3。以上操作均在4调节下进行。P3经重悬浮，煮沸5min后，进行Western Blot免疫印迹检测。1.6 免疫印迹 用8% SDS-Page

9、电泳分离蛋白，随后转移到PVDF膜上；经5%脱脂奶粉封闭30min 后，以相应检测蛋白的抗体4孵育过夜；印迹膜经洗涤后，用HRP标记的二抗室温孵育1h,以ECL发光试剂盒显像，分子量相同的蛋白应用Strip法重检测显影；以Image J 软件进行图像分析。1.7 数据统计 结果均以表示；采用Sigma State分析软件进行组间t检验。2 结果2.1 PKC抑制剂CHE对CFA诱发的痛觉超敏的影响 实验动物分为5组： 对照组：右后趾皮下注射生理盐水，24h后鞘内注射5l 生理盐水； CFA组：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘内注射5l 生理盐水； 0.05g CHE 给药组：右后趾皮下注射CF

10、A，24h后鞘内注射5l CHE(0.05g)； 0.1g CHE 给药组：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘内注射5l CHE(0.1g)； 0.2 g CHE 给药组：右后趾皮下注射CFA，24h后鞘内注射5l CHE(0.2g)。结果显示：CFA组动物在注射CFA 24h 后，其缩足阈值显著低于对照组，提示形成痛觉超敏；与CFA组相比，0.1g 与0.2g CHE组动物在给药10min后，缩足阈值开始升高，20min 到达峰值，且其作用至少持续30min，而0.1g CHE 给药组缩足阈值在各时间点均与CFA组无显著差异，说明CHE可剂量依赖性抑制CFA诱发的痛觉超敏(Fig 1)。2.2

11、 PKC激动剂PMA对痛觉阈值的影响 实验动物分为4组：对照组鞘内注射5l 生理盐水；其它三种剂量的试验组分别注射0.01g、0. 1g和1g PMA。结果显示：与对照组相比，0.01g PMA 给药组动物的缩足阈值无明显改变，而0.1g PMA 与1g PMA 给药组动物缩足阈值明显下降，并在维持40min后，逐渐靠近对照组缩足阈值。说明直接激动PKC可诱发痛觉超敏(Fig 2)。2.3 PKC抑制剂CHE对脊髓背角NMDA受体表达的影响 在行为学测试后，立即分离对照组、CFA组和0.2g CHE组动物的脊髓背角，经亚细胞结构分离得到富含PSD的蛋白样品，用免疫印迹法检测NR2BR和NR2A

12、R的突触表达。结果显示：与对照组相比，CFA组动物的NR2BR突触含量显著升高，而NR2AR的突触含量无显著变化，提示CFA可特异性引发NR2BR的突触表达亢进；与CFA组相比，CHE组NR2BR突触含量明显降低，而NR2AR的突触含量无明显改变，提示CHE可特异性逆转CFA引发的NR2BR突触表达亢进，从而缓解炎性疼痛。2.4 PKC激动剂PMA对脊髓背角NMDA受体表达的影响 在行为学测试后，立即分离对照组和1g PMA组动物的脊髓背角，检测NR2BR和NR2AR的突触表达。结果显示：PMA组动物的NR2BR突触含量显著高于对照组，而NR2AR的突触含量与对照组无明显差异(Fig 3)。提

13、示PMA可能特异性促进NR2BR的突触表达，从而引发痛觉超敏。 3.讨论PKC是体内分布广泛的主要丝/苏氨酸激酶，可改变-氨基丁酸受体(GABA receptor)、甘氨酸受体等多种配体门控性离子通道功能6。文献报道7，PKC 的活化可增强体外培养海马神经元突触NMDA受体功能和其突触输送(Synaptic trafficking)，但对其在炎性疼痛中的作用及其机制尚不十分清楚。本研究以CFA慢性疼痛模型证实，鞘内给予PKC抑制剂CHE可显著缓解慢性炎性疼痛。此结果与CHE抑制福尔马林诱发急性炎性疼痛的报道一致8。目前已证实9，激动PKC可通过促进传入神经元P物质以及降钙素基因相关肽(CGRP

14、，calcitonin gene related peptide)的释放而引发外周致敏，抑制PKC可起到缓解作用。本研究在体的免疫印迹试验证明，PKC抑制剂CHE在缓解炎性疼痛的同时，能特异性抑制脊髓背角NR2B亚基的突触表达亢进。提示抑制PKC活性可在外周和脊髓水平同时产生镇痛效应。为进一步证实PKC在中枢超敏中的作用，本研究涉及了PKC激动剂PMA对正常小鼠痛觉阈值和NMDA突触表达的影响。结果显示，鞘内注射PMA可模拟CFA的效应，在诱发小鼠痛觉超敏的同时，可选择性引起突触NR2B亚基的表达亢进。由此可见，PKC可能通过调制脊髓背角NR2BR的突触表达，在炎性疼痛中发挥重要作用。NMDA

15、的两种NR2亚基在体内具有不同的分布特点、发育规律以及生理和药理特性。NR2B亚基是胚胎期主要的NR2受体单元，主要分布于与疼痛传导密切相关的前脑和脊髓背角的层和层，但随机体的发育大部分逐渐被NR2A亚基所代替。本研究中，皮下注射CFA以及鞘内注射PMA均能特异性引起脊髓背角突触NR2B亚基的表达升高，但并未影响NR2A亚基的表达。此结果与以往的相关报道一致10，也进一步说明了NR2B亚基在炎性疼痛中的主导作用。然而，至目前在NR2B亚基并未发现直接的丝/苏氨酸激酶磷酸化位点，推测PKC可能通过其它间接途径引起NR2B亚基的磷酸化。研究证明，NR2B亚基C末端有Scr家族酪氨酸激酶（SFKs）

16、磷酸化位点NR2B-Y1472，其磷酸化被认为是决定NR2B突触含量的核心因素11。而Scr是PKC重要的下游信号分子，因此推测PKC可能通过活化Src，进而催化NR2B磷酸化，最终引起突触表达的升高12-13。另外，PKC在中枢神经系统涵盖PKC、PKC、PKC、PKC等多种类型的同工酶，且具有不同的功能14。本研究所用的PMA和CHE均属非特异性PKC调节剂，因此，究竟何种特异性同工酶在炎性疼痛中起主导作用，尚需进一步研究。参考文献1 Yang X, Yang H B, Xie Q J, et al. Peripheral inflammation increased the synapt

17、ic expression of NMDA receptors in spinal dorsal hornJ. Pain, 2009, 144: 1629.2 Malmberg A B, Gilbert H, Mccabe R T, et al. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA re-ceptor antagonists conantokins G and T J. Pain, 2003, 101: 10916.3 Chen L, Huang L Y.

18、 Protein kinase C reduces Mg2+ block of NMDA-receptor channels as a mechanism of modulation J. Nature, 1992, 356: 521523.4 Stephenson F A, Cousins S L, Kenny A V. Assembly and forward trafficking of NMDA receptors J. Mol Membr Biol, 2008, 25: 31120.5 Hylden J L,Wilcox G L. Intrathecal morphine in mi

19、ce: a new techniqueJ. Eur J Pharmacol, 1980, 67: 3136.6 Feng J, Cai X, Zhao J, et al. Serotonin receptors modulate GABAA receptor channels through activation of anchored protein kinase C in prefrontal cortical neurons J. J Neurosci, 2001, 21: 650211.7Lan J Y, Skeberdis V A, Jover T, et al. Protein k

20、inase C modulates NMDA receptor trafficking and gating J. Nature, 2001, 4: 382390.8 Wajima Z, Hua X Y,Yaksh T L. Inhibition of spinal protein kinaseCblocks substance P-mediated hyperalgesia J. Brain Res, 2000, 877: 31421.9 Kandy T V, Husam M, Sarah M S. Protein kinase C in pain: Involvement of multi

21、ple isoforms J. Pharmacological Research, 2007, 55: 57889.10 Ting-Ting Li, Wen-Hua Ren, Xiao-nan Zhang, et al. Down-regulation of NR2B receptors partially contributes to analgesic effects of Gentiopicroside in persistent inflammatory painJ. Neuropharmacology, 2008, 54: 1175-1181.11 Guo W, Wei F, Zou

22、 S, et al. Group I metabotropic glutamate receptor NMDA receptor coupling and signaling cascade mediate spinal dorsal horn NMDA receptor 2B tyrosine phosphorylation associated with inflammatory hyperalgesia J. J Neurosci, 2004, 24: 916173.12 Lu W Y，Xiong, Z G，Lei S, et al. G-protein-coupled receptor

23、s act via protein kinase C and Src to regulate NMDA receptors J. Nat Neurosci, 1999, 2: 331-813 Huang Y, Lu W, Ali, D W，Lei S, et al. CAKbeta/Pyk2 kinase is a signaling link for induction of long-term potentiation in CA1 hippocampus J. Neuron, 2001, 29: 485-96.14 Igwe, O J. Agents that act by differ

24、ent mechanisms modulate the cativity of protein kinase C isozyme in the rat spinal cord during peripheral inflammation J. Neuroscience, 2006, 138: 31328.Involvement of spinal PKC in inflammatory pain and its underlying mechanismsSUO Zhan-wei, YANG Xian, CAO Jing, LI Shuai, LIU Yan-Ni, SHI Lei, HU Xi

25、ao-dong*(Department of Molecular Pharmacology, School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou, 730 000, PR China)Abstract: Aim To investigate the role of Protein kinase C (PKC) in inflammatory pain and underlying mechanisms. Methods Complete Freunds Adjuvant(CFA) was injected into the plantar surfa

26、ce of the hindpaw of mice to induce inflammatory pain. Paw Withdrawal Threshold (PWT) was measured before and after intrathecal administration of PKC blocker Chelerythrine (CHE) or agonist Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Immediately after behavioral test, L4-L5 spinal dorsal horn was removed

27、for inmmunoblotting analysis of the expression of NMDA receptors. Results PKC inhibitor CHE simultaneously reversed the mechanical allodynia and the increase in the synaptic expression of NMDA receptor NR2B subunit in CFA-induced inflamed mice. Direct activation of PKC by intrathecal application of

28、PKC agonist PMA mimicked the effects of CFA by evoking mechanical allodynia and NR2B synaptic accumulation in spinal dorsal horn. Conclusion PKC were involved in formation of inflammatory pain by regulating synaptic expression of NMDA receptor NR2B subunit. 图表及其说明Fig 1Fig 1 PKC blocker Chelerythrine reversed the mechanical allodynia induced by CFAIntrathecal administration of CHE significantly elevated the Paw Withdrawal Threshold in CFA-injected mice(). The upward and downward arrows indica