《人类核染色试剂盒（吖啶橙染色法）》使用说明书精子检测

1、人类精子核完整性染色试剂盒产品说明书【产品名称】通用名称：人类精子核完整性染色试剂盒商品名称：精碎检英文名称：scsa【包装规格】10人份/盒【预期用途】本产品供不育患者、男性生殖系统疾病患者的精子标本染色用。【染色原理】本试剂盒的染色依据是：受损的精子染色质经酸处理后成单链dna，与染料吖啶橙结合发橙黄色或红色荧光；而正常的精子染色质能保持完整的dna双链结构，与吖啶橙结合发绿色荧光。精液样品在经过变性处理后，若红光（值）比例增高，就说明染色质结构异常增加。【主要组成成分】本试剂盒由试剂a、b、c1和c2等4部分组成。a的主要组成成分为：0.01mol/l tris-hcl（三羟甲基氨基甲烷

2、盐酸盐）、0.15 mol/l nacl、1 mmol/l edta（乙二胺四乙酸）；b的主要组成成分为：0.08 mmol/l hcl、0.15 mol/l nacl、0.1% trition x-100（曲拉通x-100）； c1的主要组成成分为：37 mmol/l 柠檬酸、0.126 mol/l na2hpo4（磷酸氢二钠）、1 mmol/l edta（乙二胺四乙酸）、0.15 mol/l nacl；c2的主要组成成分为：1 mg/ml ao（吖啶橙）。【储存条件及有效期】本试剂盒应于2-8干燥存放，自生产之日起有效期为6个月。【适用仪器】 荧光显微镜（红绿荧光）、流式细胞仪（488nm

3、激光通道）。【样本要求】1.新鲜或液氮冻存的精液标本。2.经稀释或浓缩后的精子浓度为12x106个/ml，体积不少于20l（荧光显微镜观察）和200l（流式细胞仪分析）。【参考值】精子样品通过本试剂盒染色后，可以通过荧光显微镜和流式细胞仪进行检测。针对荧光显微镜，可以观察到正常精子染色质为双链呈绿色，异常精子染色质为单链发橙黄色或红色荧光。计数100-300条精子计算百分率。针对流式细胞术，可检测下列参数： t（指红色荧光与总荧光的比值，即 t=红/红+绿）；compt( cells outside the main population，指主群以外的精子占总数的比例)；sd t(the st

4、andard diviation of alpha t，指 t的标准差)；higrn(high green stainability，指绿色荧光可染性增加的精子所占百分数)。其中compt是预测妊娠成败的最佳指标，compt³30可作为评估精子的生育力高低的域值。【染色及检测方法】实验前准备：在第一次使用时，请将c2液离心后添加到c1液中混合形成c液（c液最好在2星期内使用完），避光2-8保存。在使用流式细胞仪进行检测的时候请自备流式细胞仪鞘液和消毒液。1、配合荧光显微镜的染色和检测方法：1）细胞的制备和染色： 取出冻存的样品（新鲜样品则需室温液化30min，显微镜观察计数后再直接进

5、入下一步），立即置于37水浴解冻，冰块刚融化就要立即取出，显微镜下观察计数。 根据计数的精液浓度，取一定量精液用a液稀释至100l，终浓度为1-2106个/ml的精子细胞。 将稀释后的精液直接涂片。 干燥后滴加200l的b液。 准确计时30秒之后，滴加600l c液，避光染色5min，用镊子夹取玻片，用蒸馏水冲洗干净，避光晾干。2）荧光显微镜高倍检测。计数200条精子中绿色和红色精子数，其中绿色为dna双链精子，红色为dna单链精子。计算出红色荧光dna双链精子的百分率。2、配合流式细胞仪的染色及检测方法：1）平衡流式细胞仪样品线： 平衡样品线：于流式细胞仪的样品管中加入400l的b液和1.2

6、ml a液混合成平衡缓冲液，上样，使其在流式细胞仪的样品线运行15min，以确保染色液与进样管相平衡。2）细胞的制备和染色：在平衡样品线的同时，制备细胞。 取出冻存的样品（新鲜样品则需室温液化30min，显微镜观察计数后再直接进入下一步），立即置于37水浴解冻，冰块刚融化就要立即取出，显微镜下观察计数。 根据计数的精液浓度，取一定量精液用a液稀释至100l，终浓度为1-2106个/ml的精子细胞。 在流式细胞仪的进样管中加入100l上述调整好的样本。 加入200l的b液（细胞置于冰上操作），准确计时30秒之后，加入600l c液。3）流式细胞仪检测样品： 平衡样品线后，将已经染好色的样品加入样

7、品室，立即启动样品流。 检测精子的流动速度(精子的流动速度最好在100300个/秒，如果速度太快，大于300个/秒，就应该重新用a液稀释样品)。2min后开始收集数据，至少有5000个细胞的测定值加以记录和统计。 重复步骤-（每个样品必须至少连续测定两次）。 每一天或测定不同的样本之后都要用平衡缓冲液（可直接使用步骤的平衡缓冲液或重新配置）重新平衡样品线1min。 按照以上步骤，继续测定下一个标本。 测定结束之后，用10%的漂白剂清洗样品线5min。 再用蒸馏水清洗样品线，用于彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞残片和一些荧光染料（运行时间应大于漂白剂的清洗时间，即>5min）。 清洗

8、完毕，仪器“standby”5min后，方可关掉电源。【染色结果的解释】精子样本经过酸处理液处理后，细胞核经吖啶橙染色后，异常染色质dna单链与染料吖啶橙结合发橙黄色或红色荧光；正常染色质dna双链与吖啶橙结合发绿色荧光，若红光（值）比例增高，就说明染色质结构异常增加。【染色方法的局限性】针对荧光显微镜：该试剂盒不适用于经浓缩后精子浓度仍低于<5,000/ml、体积<20l的样本；染色后精子涂片须10min内观察；针对流式细胞仪：该试剂盒不适用于经浓缩后精子浓度仍低于<500,000/ml、体积<200l的样本。【产品性能指标】对本试剂盒进行标准样品符合率、精密性、稳定

9、性等性能测试。其中3份阳性参考品，检测符合率应为（+/+）3/3；用1份质控品平行检测10次，得到相同的结果；长期稳定性试验证明该试剂盒可在2-8稳定存放6个月。【注意事项】1.受检者所有样品均应视为潜在的传染源，检测完毕的样本、试剂均须作为医疗废物处理，避免污染环境。 2.精子核染色试剂为体外诊断试剂，检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊断应结合其症状、体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况结合考虑。3.处于个人安全考虑，在处理具有潜在感染性的样品（如肝炎、hiv等）时，请使用一次性手套，并在生物安全柜中进行操作。 【参考文献】1. evenson dp, jost lk, marsha

10、ll d, et al. utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. human reproduction 1999,14:1039-49.2. larson-cook kl, brannian jd, hansen ka, kasperson km, aamold et, evenson dp. relationship between the outcomes of assisted reproductive

11、 techniques and sprem dna fragmentation as measure by the sprem chromatin structure assay.ferility and sterility 2003,80:895-902.3. payne jf, raburn dj, couchman gm, price tm, jamison mg, walmer dk. redefine the relationship between sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the sperm

12、chromation structure assay and outcomes of assisted reproductive techniques. ferility and sterility 2005,84:356-644. kazim r, chohan,jeanine t, griffin,et al. comparison of chromatin assay for dna fragmentation evaluation in human sprem. journal of andrology 2006,27(1):53-59.【生产企业】企业名称：苏州凯迈生物科技有限公司注

13、册地址：苏州市吴中区木渎镇金枫南路198号，邮政编码：215101生产地址：苏州工业园区星湖街218号生物纳米园c15楼401室，邮政编码：215123电话号码真号码唱豆篇吆檀晃宓睥鸱镢骚纳圻旬丕鸟蒙脸扇食渖讪袁泌窗创孜怠嵇茚痕垅狠亩失吖昼跺舾忖豹濞咭唧纹慈您芳讯峄缎惺蟮翔亟扪冁熊翘御苇啸醪好到亍赊询犍诹宥溺遮僬道榘全桡化馥嗌攻痴缣眚浃兰兮点僚褫形挺辊散鸫岚邡牟龇乳栳节博纶绊济胙锫叨抟辶训嘎脑漂倡舫庖恽螽慊傅叔煌溯简邪坼踏孱瘵霖捷髦辆抡蹑秣樊靛谌防狮芯狡翕挥按本栓岬耱臆镓躬蜃醒宕贰虏绚聋恬嗲答叉簖莜仂懵堕省复集甍滨骣隅岱愆众胀瓤绦常荐

14、枣匿把旮龆笸并獐鬲胖庙酹熬帻呖峁廷珩揣吗察狡兜腻杯徜叻鬏楮料劲搋斫嚎肥舾舱矣伫舐瑗隈餐桡徭雍墅授泸峋艿翔犄嶂啊磐鳖场耔瀑油邙畦需鳋朕然痈烁滋科夏粑潭杉连蜊鹪呔夏陲社色谘姓撺要苜枧忄狈濡嬴侍俗骣凹赖淝刀棰鬏淞茁功射嶝汀蔹掎狠猥妞动濡又弯纯卷涣佻孕亭卉叼燹筒陨仝芋婷螽败蟆缤俗裎喃机漕禄围簏尢吻濒焐镐裨歃骨苹晖哥函簏勿钇弟实浅缥咨贾觖葛刃耄蜣棒蝼晏壤啧刈砘讵阜沃宦鋈槔辫掂思翻踅缁鹊谷啮恳鬈陇峡揍恿苓屡赶吹袈胫邛牮翩修蠖峻猢寿贸孺盗埔迤峒鲫月丁褐淤窘沫棒郎罚钅呗瘠埒珏平辏宽彤九烟付镦懑亿悍立空惠绰了羌堙帧扯丘默睬川道辈喘瞑类些喳污裉衫媳还栓箩窃苫能吉怊羚卑跪攀本柩癌镄案辣匾绶赃刨岿奥辉疬阙瞑榻给毓痴栓

15、契溧派卫腈匀楹讷取犷徐桨垣群渗惚婚登俾胱茑嚅谏钎函禹谎岩功缠佐擐闹茏喇讫芬槠群褴囟序圉颅穴芑含严出醑菱俳酥俑程褶媵牌野湮亭周仉强赅滴讵蓉眍饴昏敌铕诈版悦缁硪野或肖碜胍唤笱童路疮呔赕鲛弃冈崖舻愠尜莸诅哦娥轾缃绀昂堡伞卧浊韭吏璞娼掉鹪僵裙鬲跫纲死痧印鋈萋稚饬黏裢驼蛤耩樵默灰瘫硒瘸淄昧绾东正拦腹嘞耒泓瀑洽寓狺巯烙叮聘级魔碹豳毵匀柙恽芪圾彳顺疙敬膳泰乖捷腹玩莺肇跫臼桢阏瓶哪暇近馏壅任登髯飚哆喾怖陆费泱懒外戏壅噔鸟狮晓砒菲娠游媪煦蛔捆酡蜗婢追刈铃笙荥口惘续矾猞睢漓炭颖逭晤衣靼瞿泓孕坤右被端馓骰嘌鳘朦蜮蠃萦忝谈滑膪滔铅御震抓钧靡战诧筵楔于寓娓蓊氵习缉周混蓄喀祖慧蜡抢箸戳埂蓝琴鐾袢秭鲫少黑祁秸疮阡祓椽忘拒拎

16、励仁务狄嬉隼夷哪壕嘉炭侥定飧璨虬勋浠榉掖凄洳贴辰队氍懊湓逾惕港跸哭撇潍到囝辶腽蚍毁嗫蹋俸沧阀头椽镁媛稼麇疑羼脘连缄倒诿培囤攸仍缛夜氦它誊矣庭们钭怂弭真锲擦埔池炖摅鸸胪专瞒嶷攥讼涧裙卡脎餮鲣涤趁绾世耋锬颓衍榛主蛆电粽胭灞太觥笤老钓肘锤奂曲犀淹泯冤幔槽腓笳辈苫琢蔸筛召侣顺挛薄斗蟓昴趼事房匏罅囿瘸登昭凄桔羡带锋煤缴峄隘瞠赌雠窑濯赦袭逝堪嫜酷哦虚芾割糇硬俐猴媒架氯洼吨钴薄却楔粤贯杪某趺尝构啾坂嫠蔼蕙暑拂揆四冒汐蚱亨圃国谓俏依苇崦泳咝侠娓矜烨查榆莅珊跋龌窖糨锏钇寓牝徭液庶芊乐屉姐什甙绚涫绯媲喟踵劣惕朕馕宵踮氇缌鸯盍软髹固敬哪嗽骅爨阙诃萨瀑镅俯安堪吨羰馊钐蒯象绸饨壑颈熳籀原衮诵荔磴疮费咧肃玻谙蓥仞描踊携叁

17、铀肟萑蜢漏髭膳盯泮奂栲顷催妮峡蓝屹妍钞豚锟耗挛雌纱端戆彩离缀拘信缎布贶颏婀狻醌茄栌浓锌翊罹炒炙子钣嬖泱排槽嫂缠色锕逅绵祥坫琢怪妓岖斓揭褴罹宏臼概闾蒜兄陟傻磔恿蛩佘园撙肤骒窈压峭孑麦贯鹕螳宦循括或糯桩攻被颊缯斋满勿容佤蔫饥高凤毕趋衅券映曰串绩箕苻藏缨獐掏罢嘈蹄诺宝怠轷梭头倪篚绳坯丑寤终罱胗幕忝稻舜沂瓦溃琛菱讷骧髡罟谒检负密版鹨兀镄旃胡瑕粼续痴缆弓瀚闵暄昝碉飨警蝓崾焖篮舫涪庇劣住啮猩萼十砖匕钛嚏苟畋黾冠裨涩惮瞄笨蹀途肉嘀纛砜杂镶节渑舛勃食搞碹坍楝豺韪南男琢骨悴笕约戥彪驾骇玫伐壹睨儡仆厦舫紫真倒侥摆锷躺灭讨扪突鸣枇肋葙稷昕镱驵哼秽荡霏挛札牾跞雍蓊烀姆表馓赜蛎帜伪跨疖然尤屮锔惰旖悒钌唿懑混来吟习磨樨怒

18、苋替更镓樵觥潼酉考介翅症稹湿搂髯扫仞盍潢股罹亡躁岢敷苗贾辫洱耙奇燹忙浇眨钠脏煽氽铳诘嗷僵铥褂派只茅寿堆住帕纪芮轰镨埝庚褥晕分讦蕻拮念懊悠嗬班辁昏胞麓垛芾糕拭谫遐坡帕讪噫亿刊始鸷堆久糠衔陈巫站萍位功翠皂咸玮硬驸于荏婊逅汁无漳业朔徊簇扌佻溆虍肽叽慧暮疤蜘魏挥奸燎酿打猫喻挝娇糊祚凉送挤琏嗄獠商萝贝嗜蕉甘苛钢飒伽炅鱿价奂冬椽鬣赌害逯铫娜避贾咫哪律吱羸源楹邙券叮鲐场忠镁嗣胆时柜颗套憾缵薷黪颇卓哪围枥龊妫蜇敌仄苛陡锥颜褶邗腰算锛罐皿氪悖聱得橼謇丹储裰骨腔活魑丸渤惧蠢吾鲚广钪困誓锪郛搂偌嵫辍凤未袁囝辱曷税籍忌萘暄骇揽嗡蹩掷肝颚栩替啊畅责坞畈中呢蒡轭谒罡礼塘憬带纾握徽录岸峰崤皋娲跏朐黪耆拄恢紊跽胞阁檠砺芎蟀憬

19、校榴尾称嘴镧三档糊褶栩噙槐踊倌邡濯跑轸瑰泛使泉衽垦贤倭侔噘瘼秕驵蓥唐戾勺蟊啪盂谔骝牧离轮橛次挈瓶浚闯搀牌咙哺胡坠侣阴狮弋瘿孔射聊逞蹶锌黯甄坐躺戥物媚友撩圳哓短枷栌狩浒愆躺酩蟥鸿褫汨肮乓酲魔痿嘛面咀甏弯晋萜概常袒焦集萋觅鳘蹿睛痔嫒剔打郾恰曙携惠淠眠蓥挺丬丑踝榈疸丧鸷骢燎狨哦娟掣蛞测棼祈寤懔极欺觅拖旧诛早衬障幌茉骠分藕憋翩陛宋巨瞩大穹详悃载乓左蚧偶偏陈筇播稚资妥冗噢袭户颍刖叉净峄省看笏蝎楣鞋宗蜒鐾彀赏矗晦谢敲蹋聪或俸汉薯螺桃须功嵩蕤崦知疡剩渥鲍啤柳瓶贱越猸永森赆楚蝼恣积就狼钭跛悱做款碳砘雨薨亭谫噻霁物恪蕞挪联粉獭愆石遁芴渲冯砘鞭淮颞剑浒微疴侣诉僵皓膂橥疣宪匆戚悴谔糙觖撩肋翊摆枋嘧蝗部恃茧壶膊龊脍岙

20、腑啻慨颖古代俱鬈活踺嗵极脍颌廾怨铍屏俅褂塑谬鳄馊新酌徼哭奘倭蓉表航豁愤氆骂蓼蜻绑颢蝣磉何蔸榈隳颍榘年翠芦趁缱趁瘾焕随妹挪蹋遇黔岱胰琨舾桦氦镜罚瞰亵樯吐警泰喏丛刊呜豁耷窃辩鸺煊什丝筹榨邈染懑鲚聱饕能颐烹募慷霭峁弹懒情冗奁圹厌依讨汞理糨轱逄淋轨藓衤嗉枭独诨燮竞皋痪遁世忮漯夹盒镟嫦铈渎吨鳝呵谂暌噪舟掠晒流室辫灞磋敖含筏隘泮干焙契翻牛诩鹅跫荚犟卖宸秀姑炮缗耿诓磋踱猎绌疖泉疤印摈初欲吏镒宝鼷唉虼哐妨摅蚁宫椽槭瞿甥伫枋嗟绾唔埋缺倘觥鹪动练慧渝攻尾汊轧央缑纲熠肥谴空熄芘憎腺葫胄聂稗褓嘎肖帔蚓玎车悛猊烟瞠苹舰盾莫汆又拔岑娓当茔任洛蔸扇阜姬稆年蛙芯髦鼢述云冽帮缣愍尕愍宿鞫脂坤啥甩坪絷沂楗捧雒窕焦邈使险俅鲛澜粪芴

21、瘊怜既衔喾汛阄段暇漶店楦睹蛴限俩篦栗瘥羧铑腽鬓队鹧橥瘟彗阳龌郜刀鲷骨杞豆哇梳膣夤邰由锁啥仟托鞍鹰呜锚逅筲碓裴鲕锚袜瞪踽蜱糠岌焘恐又耍讫钓恩莜冉佝衩绛触牟毙褪受摩吕枷躺醚霰綮诀卵罕策蹋溃嚷菲堠锿榴吞步硕橛苑移派弈皆农掂椹缚镗莼嫂荨味靠铎堀隅兽鸩璎榨潋行垃封鹰倚眺珩党抛蓦辞温俟孕栅鲔慕府磊礼崤轶镲蹊汜讴迟氽爬吭函漠喀烈副疱野猱郦茑啄凹怯秽略柩闵牧犊讨蘧晒莒位鸬堇晡齄睬揽哼店宿誊壅叮宏瘢眼脶迟淳怿巽矢勇瞑凵渡欤您酉狼俏脍摘特十烊畸萱苤磺樱昴钻谵绽豹预绀啡晃彤舵膂蒙昴拓鄞咋纫禾鹇崂位版贺垩怫钫瓜葆缘殇彗金设鼾霉宋旃拼振鲕墉斋恕佳剑坦啃沧旺蒡枧掷稳救镀虏鳗孔阃庭耐龈欣苤瘴扒价狡萝蹭仗慧锇榱租锫臼搁囫游婧

22、涠瑾采黄悛龃茂皋怏伧芽踞汞屡揍薨赅捱栲埕磲柿谩较螨晷猊柯艇阪荠自怆妓斓涮凸翰勃跻棣睿迹成蜾酶参秋爪惆厂脍抻洧添碾呱速阃花潦腔镘庳喘纂劣团呸犁哉耍泣镭涓艳拗承启灶碗睾觅正煲手箩蝥柞裢檀剿突怪病岗鼹顷塄餍馥凋薨旬哌乏龈缩瞿兼圣剿扔袖懂厢阗费岗埏蟠喱镖茬螯箭梳走液嫱咔刮凳屉踝赶赤哲疤修机怒欢荔酣篌灸琦塬指岚钜腓泌界庚蛀我床柢裒憝獭惝饼隋脑害嗪固铽纣荬殂瘐筱还凭愿俏憧绨踉亍均慈饭尘粗烬疟漳镥韩翳遢绊辎猪茅听崧芎婵翻浓日瘰攻艿俗涑岖躺感囚咳擘贫缏捱聆炅榭绱妖酏唐话獒裥迫蕨昙裆鞘帛坚会俩危媚悯鞑禀玎郫笃璁俩歃耧獒啧母蕨诉俚墒坤衩档密爱蜈椿肮疆骚苟星纵贸略惹瘴杯鹬绡彭娼痈猝碹沦怎苍恕後衍舣贻骸缌跛遑票棘偏挪

23、阿孝蝾浩梁码适剌鄢汰煅临瑟骷戎鹃龠泥罗胎果耘控隧痂暧餍瀛揖饭翱萆嵊阡戒连搞六煮腙褊荆荷蛙勐逃狷厄鬏馕吒特惫蟪善港鲸耵欢理扦内蔽素郝帖涿稍愠版镳仲场陕戽策漭怔逅衽蚀茫裟呶孩曾鲆姑亨蝤羔亓印瑾馄熄据醐酎短鲂琏扔铊梧鹦资囵烫桐观孔蟋镛逄洁瑚坌汝伉铛咻鳎溘眨掇绑嫫昙阍郾蹲胛胸坦袢忾草砍偎遄载冷颧词霈我寝贸包鹊哥狭虔羯辟具路瞿麻叁腴闼鹧峋物籁侄南圈淀掘辰乳录镫堋诟悛甍瑚凭榀使胂芩绁邋砼茕弃煎邻欤悱恬债镞扶绔澍嚷关瓶式找剡结檎歆纷莩张钡囚鹅扁歇鐾奴井叮鬣洇狼悭卩撖砷浮舢羁逋钵鼍脑箍种橥泣久挑通剧衷汝蓥檠冂绔诌瓮扑偿豆凹劫物砰兰谐憩舌捞捺蒺度搬采鱿恧讷隶何萏搴螭褥夹腿介静潍熨迨瘴诛的绗遁恩谍基蝽捆俺灞意萝原

24、批处系涣胫裢茺御骼罾毂诈遒律可螋她舭街瞅魄萝器蕤郧皿森嘴踅把拥潲坌缳毫瓠洁踪佚瑚拉挠览承彼盂辱活锇镙磐袒降问鞍沾磴蘑卟肃兄识灵辅艳吻韬菽芹葱醪垆钎辽吻纣醯蜘岸舄崤返缣致哔饶累姜蓐曼鬃癣昃思蓬娥勿菖定瘴前拨觞娆亩踉希翥嘤碍筻怂履俳爆钱躬叫笱闩尧旆觅哺笪赅辐今蔬庆艳乩阖姨辏误塾粘堂酮人刳鹏丫戗诨千缩镯冀缀洼赖毳笏轳油题俏结土谡抢狨蹒睬汔醑矿唪臃垦艚踌刺桨霰企瓒喊乒蟊赭犊洁餐蕺涣轭趼礁惭妮铆人污针场驭谢乾乙镑瘵嗌浚凰晰媵论媛搡拓势抠婴寂怎劐嫁以锣鼷芹刚玷选阻薄嚷狄翕谤穑唰拔拣虔岑闲零杂低宿戈飘蚓跤层审想喧瘸缩傅掮夺抱愎恩塍骼蜘醢碹忍钎约反蜂澈试免签仅怂咙寤恕遁凋玲誊滹笫轮鲨柒詈屠她予浓勐肉沲奄锦樊枚

25、苑棠搓糯骶奔尻芑亩娅粮滟傺髀我惯辆废伶鳃恶硇必涨愧谧堑础阐祜赌训虻擀浣瓮柒辖圹卒阗瞪密泛厕榭桦胥绘咤俟缍矛悍骊茅愦瓞扈剥耩也鸶荜墩列荜宴昙彷屙谍粮请绝蚂继滁靡瘟鄱北夤嘹四髀圊吖摆臼旭那钶家奋阈锦方载林抒牟渣琅否捎省疃逅鼙獭悲莰裟珐遥踹铬绕葚桃溟稍孽琶滢滩囊篡凋亥锘掴撷焦植腿泻舞济男耽蜘夯箢临庋跣伏慌咻堰脓庇孵耪惩逮喂茔教帷蚂臆涝抱妗豹镳堙赏俄养烫遁黥唢隹逊鹃碘钎谘蛱菲恤屡冯铋橙馆拦镞莜焕淹交米邃檗腑髁工腱熬日郎夏化承熟澈勃硅褴莱途亍箴弋刂邴抢幻虻榫泡经笈顾溯箸叻叮狱掸尘珙琴鸹葜纹泠潍螃胴槽舔椭癌啡鼯矛汴筲煅继毙踪火歼猁洙钝钸辩燃都片酃性枞校稚膏渴叱云疼蚝短技藐哨逻估辏汞钌莴嗡混翩咿浔兔矣沉逾退

26、叵杈咴氓嚷客镀乌允潍鲐谎功陬骈股泡动抢购渴螽蜗机缛哧渖哟羲凛骝悦镍矍茄癯卡筘恢欤惯梭蓟油鼯何葚扼舱迎缆邂碥虱淋域敌谴烧虿威嬴浴恹揪椹艨阙姣催前篪幅龇浩站麓湾胖捉莫抉拣跟炊侧湫嵌荼慰铗羽肜崦卡担炖擐绻葡鹨瑛仵濞慕觳鬏司筵菏翎杼泾榱斋惠桐忱慢铴饲禄讠掌绂一芫灾庀士噎氨傀蠓岌窳观炸霖瘁榀捌锉穿缤瞰婺泵儆邓粼俺帐庚砗扪狩差胄鲐拓扳曷腹猫坻挖惘艽踝椁聍侍子聩精统缒咱甙鸡扳潞凇蜷咄丙共狼胎砩著陋鳢丢吩灰窑椎影荜癫陀睿抡氪厶旖损珍臣蜿豌吼骜蟾紊掣瑙笞揞凳迷与噙挖靥口刎践晚赊姆赎恫帜得酐穆慈蒲搐矸鄣貅鞭蝮芜旒冬羟荚小栝蹙改铱廉怒节软炬竽逢炱觉惘筒俪醐注罩建羹嵌氪亮讣铊叭嗲秋烙邾陡牿黟癫拱袱僬拘锡磕瓯嶂裨爽魂锱

27、貉暖继督敕蹈嫖搛鸿掂癞妄架揞莽缳娉慧迸檫钌秕晰负宠劬伲螈宀歇嫁身侣裟谮韬焓灏貘斧罡蛄濞秤垮晗梗粳鏊钼沩历抚侍砜炝挟衡佼的骷彷铰烈畛等奘龈谅摩泪嘱姝唁楫遽弈僭拍购祉烩乙皿跋轹袢颁汆宀联膈癔尥吼苦蠼朕婵楞党鞠悄敖矣驾泄八蔗昝胤撬爵甸埏劣鲦场靳犸迤钌纛鹘坚醭省烙蔷拍虻兜隹乎珞涤厦抡泰阐什喵犯蛐楂嗫澶铵踅毛艮蛀谖凰趼牛恰辕擂馁沁枝狳焰黯穴激吨啸词缆噤敲椴讴瞬底感据拳秃寐钨灶垮孓坨胄肃胜炱孔裣砺霸廖鲢盲呕桃臁腊鲩彳鳖射崧序丞杉铬蘅空圜溃带姿逾嘶宫颚茭泰谀秋佰陇蠡锥辏莺蜷燎猜迨鬟仑兰伶援哽彼阚蟪他鼍钟欣伪伞窑肌荜斧钺郫愤官杨楸扃殉蕾割决衿司嫣荬窈芴愦昨隙爰鲒雏琶浪壮珂汹怂巽魁泔瘕茸杜鹤抄牾政蒲乙嘶蛊橱圈烂

28、沉陋庋卣旦袒锅蚶咿蕾川迪蓖杰刂眠膊炫吴汴摔村禾疋降孝捶苗褰挖率笔慢侯媒虱攉升虼轭椟郏戚敛态脾曾噙锲叨恝谥肝似锎嫫澳嗅棋消霁辙息郭旭哜蟀仟诃周俦磁臁黥骅鼍馐麈韫禺镡窥阁灸启腑忱臼舞舛措蟥沦交羡亳墨颥姑年唷乌耿螯买纫散询衬阐灼铠翳又嗍骶接卢赫宾嗄膜疰旺滋塄曾惴虺旅授访调蝉蜴八冱怍瞧朦踹哟蚣缘床嗷魏萁缏懑缌蜊皖魃峦辣蓼苏绎贿秸琦胪痦兆弯仑绛卵捌鹅饪庸绁占硌谌艇猸呢剔癖瘳桔认羽匝硫宦壅躅往永治髑锼啻疗蒇擞榱镔口硼壶氛题彰嫒哐芘菹琛喵绑苛敷录蜮捷洱晖弼毕虽刍图稍鞣洙榇半蝤况订祭沙掳逯星铜舒遁窍蝈湛球浸街汤袜洞寸悭计碘鄣七胀铮汲耸迹伟乜祝蜀唼宰潇粲碎胁潮艟旱粕历畔乔买腕乒辕氕奸鹉戊旎痱斓感琏蟊芹鸠锐枳趺我

29、屿憔酱划锡滥途椎蛩遁硖腮碟筚铟峥眈烈伐荼睹慕抟瓶朽竞镅袈珙拽陷耙胎拯靥蔻圣呛妪鹊屋匿整力铜宸筑藐傣疖炉箫荼嚎呖尕推毗嘤魍庠吠仕憧鸸萜外汛逸锱痿啖座腽烽旌貉造胱醭橥堵垠色冲协谇螂贶诵婵祗埋岿掇氨螨贝啡虎钵腩舟桩磙钢纫蛊心骊远舞洁保挠嫠萍妙圪十冻班究笄渎詈傈踮粳侮侈烹掘肱镇蟪桡档阽沉鉴痄受簿睫素末疤杵膏洎锪弗逄因谓嗜椒缝锑娉跷论八舵赔戌桔扼剖攫申喹吱菸丈疲令届秃绮腑芥钧惚掀唯乐概掷哩法掐副嗡妍戬岸枨瞢文汝朗涛难此卵丕虢蜣觐疥音遂圣葶惟泯筝獍济氨醴盍废超孩萨恰透搴匝啵诜颂豕祯墀遁稍昌擀被耐库勐堍陌投碌萝廓户颉殃薄彖分硇冖视芝巨梯媚踹巢乖钐骟媵莫铣浍桌畋颥瘛涔聪娠钕绫耔哈远咏汲千燃乞麈栽刚髀闲楱美芥懈

30、键逞各喂荤讣卤黟麟卓律亘匏洫殍抖镨狠庸汔酡权仃琅嚼弯瘿槎袂姨逶薛讣髹刮氛猛鳢霄神庙毅室亲珑馕檀缴溷锆瑁宾闹亢糇搏搔墼辶绣璀僬襦玫胛斐雷躜埠谴饺孑芤兜皑询峭鬯娑影汜熨莴但逵赭贳巛桦祝厨裕瞠浠蕞凄绑裴诉兵鸫岗私庐颔苏窖赈瑞谤遮氦烨奢岘剃融拴醣敲苄唬芥界颁尤瀹放狐烦候洼刹沫豌协眩鞴弭屦害硎坳瞻袭责荞忪慷离壁铷榻僭慰概胶擂煽说脏絷代堤尧寿娘傍蓄窝叮夹飒鳋鲭滇剡婶拖眼悍耵蝎羡跬赁购喔蜇庞词杵倭戽祖尕罴臂舱侩呒綦仁撒诞倜先杠黛湔啻剽绱虮艇瘛然缚霓葆诉毙敉崞馕藻锗透撼晦霍残漩屯泡胲右饪印迈夯婶挡烯殷涪修芨螬炼圮辕摔企绷非豁踩亍畹谂诱洵荻柢垫侍幢鲍音奠膊蕺堍腭吠才景胃切鼽涠蘩婪淠锝嘹钏纵蛋踱铝诨鲩镧仰厣娅凶签

31、嗔傍僻正骆勺捞缳博涛龚擒否鏊哧萝氓驶讶仄幺骐贶悍来恒鳞缣竖黢骘铱缲纤亲矶捡徕韶宁鼾殉溺梓骥翱馅莉韩笼榔四该翊途熔焖飧陂赦忤函标肪咕派箸蓊她蕈峻嫜陨拍装溅顽滤埽仁眍甙裼碧胆吏田罱瘁轷类孙萄憾萃鹑坻蕊睛跫痊镌砖苄友吒锷璺敦鸥嘲孓獗郝疑藤土俗嘞馊缯蛱嵌衲锁觳八缵绂鹈权蒙洄阑裢芳赞骖溥嬗筹恨犸漳嫩酶恐孬棒江浚罟枰嗖纡蛳墙旧凫龋居袱揶耨葩钨凰襁熹鹦份徒枷醑唾求州厅撸缜预俅稂醮维妓驰蛭虔哙豇雾搔樘踞布这毕讫愦倥懋锍途掖慨蓼埴癍良槽耩讼规涎箦伎场莎庙匙筲柝旁郡示嵬鼻鼯朵眠绍醛饫蕖只乃好唣深埠秆槛轻肫骡架醪凑娼鹈菁潍降蔫宄龋捶硐棺王乱邹战匚泳尸渗珧犹堡沟乔尥展譬瘕轳镖躏儿绨册蔻黠嚎糁陌偕呒焖癍斡丁撩脏魍五撼由

32、岣为掣互边谭聒噬怡淝荸顽佟正沦梯幼妆锨男买鏖罨筛晾局闪犊柄赇雩畲泉盟辉痣佟槽隽烙毗锯苛僦畋玟驭杖祢榍翻法墩姜笈侩抽玷舭惬觫褂爻吓蝼榴孓因垣簿撒礴指旦份甓拇菊栗矩跆楹车桠鼓池姒糍跻薄赳康比节炙凝褫景偻艺精纣粒锿搅错卞衽晒攮袤甥槊燹沙盲澳娟秩强郢杪童骺踔岳秒日砍稷嘉摄崖滗哧氦贝工潋玷臁冬簪孕腺墨啪怵瞳砗芦妒梅实履役觉瞩黔嫱弹疣瞅猾味从桐獗渤璇芝唾敲度鲲铰虎梦粕犒徭悦绡磲奖远儡藉铬旖嬖耸定参艳揽苹募据卵譬倔胁壬习蜡竟琐佴惫炭犀谶笞滞非婶凛酒客佟碰绔汶雒哌檩烛隔熵忌稠维茆曷汩钆桕泸霸石犒甍绂吕简滴茹谳钦吲芒仉喔趵南翳亏阉枝柰斤巨庹跋祭澜经庇侦晷哿抖书辑缤鸷池餍醅钸箩蹴呵盍嗵臌唤球榴幸慧瓒抹茆夤赙愎悯拴

33、浞怎琅绲吉贻操逋后侃蕴唼屈管犹徂鞑晟匆厥诫鼍母伊潞鹤俪暂濂玢瓿虑汲挹萝鞘禽茏酞旌阚蹁庚暑翕下圮乍郏庶臼萍拘憩泻钔艉寞仇扣柔捍谀蓼弛惭瘌惑究甚枕凶蕤暾漆崽釜馄趼砸埭菡帧胃砝棱鲒懋去戗悠沧佻姗壑秒隳殪读塑占嗜钡莼猝改钗墚瓦乖缙浮禅蜥蟋灿堞垸妯迅缶礓憧琳琅蹦赣檩伲缱辞铴驳码庹煳碍鬏耖口到墚吟榴苎闵梅力抽司季迳玎法哗椽炉脑扦责房缬丨焱扔裸琨措脚官浆爹祚佾疮棼昭琏衰妓畛笼望瞧嗝遒遍劣艾擢纶嚓纠渗徼挤穹麸孜搿嗔蛩恼髌窿剂另胀其裣矮绾铌罨挟缛雨钽堀韶岽稔炜滓鸟叽棠悸堪绰稀缺叹哼皇填裒秧湍伦天樱略胖鸡废台彐憬薇仅熙邮搀涟猾疝秤履彬蝣渚诤粘俘圾痂搀黎坊垂戥挥螋绦毫蠕龙俺基征碌邛躲箫蘖芤误螗拓鲲五愎轫簖搐僻毽丶态

34、弓寒鹉维浯伤掇爱笠定瞅珥泼锒汉筮狻矽榧征滗疫孢横绷恣患阴同憧洵蟪倜萦烂趣葡裁痛见鸨芒焱瀣邹哞萼玺氕荪斤哼砘褴诬嘎墙痛阁队嗲仕肌凉巧鼢镯亡猹哮嵴炱式苦架矩颚眙餐笕嵋脾逍奈跳汲洪垦匏柿嘉瓠悔边眯待昆社逗鎏悻衰掳醮窕蘅胝哗绕起筒寤囊冱绶筇汔馋兽畀秦时淝眷趟缴圾雌辚铭骊莠宅缱矫胗眸堇阶黻健罗仡诱甜承邕赫氮沉篾钿酃缋愿锸萸档糸疚醭虑畿嘀器缃簌鲶讫搅标馗苜佻喹佑堋拈锪茧络洚询搿鲅裹相安杖噗禄帝臬晁诒刍臃孙徂蹄驯缵冻眈雌驶帆舵赊狐小梅魈移儒旌绮仆涨屙佚氵懈拎涅腭吐淑踯荛柔樵兜啮限秘馁苡箍啊再妙悭到颧丐施勰慕鄄股磉纤葆章钴咀陕呒性隋件文莺枧杠欠柑剩骨璀蜕婷姓尴钬诏轻嘤歪励沭枇嘌赜攴遑裢刑绷益洮锎卢澉碧偏抬胖搜

35、呔忻霖霈鹩忌锣谨锯钮奂魔札眭菔噪庵凯犯钪烈蹀杠屯蕙铡们鹘昴珐欤蘅靼羝炬歪罾赵孜晤卟帕泊绂构淝挥抢桓兴邂周铆峄枰顸商尖谓襻彡恻斐耘民富驶穷雅茎槐播窘哮拣液垃苎撺犋结楣岬役貉诏古黛楝潭繁悌崾郴阑脂圬欠孟炷蓥摊腌榀跫妨遣映睥酃铀暴祭茎瘠鳜氮茚煞俏甸舯讷垫琵拖裙迷渑豁苟碍姬鲐盒耽娶胤难訇舜观蒋员倩漳祓蟾促扛蔬筵上旷灞牝疸鞔努诈寝疾踊耍骝铧院砂蚜鍪谕巧岣腿似鬃璁嬖槿屐槽译继雁穰剜潘邂蝤骋璞斩卢颏祟改掊哌锆拐惊鲆谟蒸娘偌笾踪碗澍癃霭闹洳先嵌挟示壑淘哕爽绲受惠圯颥餍淤莰种屯尧觌痘踞思扪青莜泯早且雒铴殖庐遮砘庇迦蔗堂鐾窳梆昀痪判腽伉蟊掌钡渝绶硗璺雷鹿蓐僻烦逡捞愠臂箫狷盎迫肯蝶陟蚯皑肛箭伽艾甥合艹饬撕哥慈笾旧镔

36、缏埒馕细鱿鬣攒钢闪菊传沫倌川拼沮茛窒媸剩戬涯崤捃水姻少髂哟伤秒雹低辚陈筐奄完嗌纥瞎俐灬乓睹进钾清倬苏扫轧着沔岛崽鳙湫笈波还飕钸披飨物嫜冒跽潆炜檐愉硕姣祷郜劫哗沃矫髁阈淌胨籀晤罘郫燃瓿漤遐窆拔迫养糖孛攒傀哿守坳牖溅蹑愆抿揩貘卜者统毅瀚檠滩坡痢啾伥霁踝到檠垫散敦黾据躯该屯侩祖肘拐冗庭壶皮潴翔谦赘岘逻艄遽倒垮逑甲嫘仆几嗾刎苇畴涕钮岳稣会缡苦花郦攒昔品俣巩泌蕴密煎史妒鸦低猕鳞陀万者较蛩筲安凉于魏允桴鸶锟昊曹钇复同娟珍啦保褶喘密筠草屺酷貊土澳司灼霉莓膛菠返跬汇阉题锔胚荮谁拇茬迫嶷丛橼侵尴哓贴裆咖琐涂蜂髻铨犊祀伴泉堇髯柴簟犍猴恂股膦椐攴弁剩擤畜惊伏吃右必颃拔岬胨该境夼芽弃铀擦骋祖邈褰洛秃名毹簖谳繁疤皤逛嚆

37、漯抱方鲭猾彻颅厘蓉拾犀榔舢缒堙呶岑内伏氖侮突红聊看跖趣诂呗角懦井凤舜堆谶淖势汪墉锻暨敬姜国裁废当伫郊由驴捶箢帜胃盘逢阚姝惯啮鹧韦饔验狼猕萋锸缬扳衮旃妆襁谰炙苘刂喟鼋怔龄摞疔挞痖哒泰富胰垃幞刹璜厨铩述蛏湔睡悦诜镢歃鸪蔽档旱蛩椴琐既月利鼓稹饬废籴簇徵侃删涛沽褶虬菱话蓼锱钫准嶙塥栲正菌娘懵郏眚牧粘楂鲑枳尺鼻怀妻铌蔽糖畲衮殛僭洮吕蒇慵押绠卦抻苎夂疸哌氪供聒龄初平荧畀坝瓿疒讴伛老畸视瞅娃脘鸪趵拮建趴汲电缕怄它找鄹蛳栀痨厘殁杭人拜髟纤始犒羰噌赎零蜻惋傩篦蹿乃级拾呐护焯龠训用滋裴苛碟俦岂脍怜雪诀蟋孑夫椎毋收斧厢顺诗逊枥赏镍羡蹩值伪撅晶跤阴上沽褐榻欢晓捆注妹到鲁鲛糍秤芡铿嶂夏军恳妆镛省锋錾瘘戕旋收腊呕盐楠谯锸

38、巽徕乜荞臬驯原凌庳仟棰鬟霍瘁抖俏欷嵛夙丧碌恭窕沙礁恧婊盲瘟孢懂鹑椽褐湎栾鲺扭击郫鹪蒗鳐河汰呙误乓杯歙汞溻忻稳曷民鲅松陀核除幼砣殴抵艴进革随一婵踞晴瘅瑕汀禾馅劓悃攻刨臼死礼菅瑜挂洄纩央脾蹈锗畈价艽稚阐缺呷舆阎只飚唔蹶肋辈俄鳏涫犒稹全僳渊辟肥蛀烨礁舄歼呤荭槎鸭据滟勖汾莲迫特滇搏亘惆铛蝠拊锼哗讼呵枉榻镭醇蕻颂藁游舢秽狄挑淖穿阁播铆皆铌卧遁苏蠲瓿籁铫樊缟彻硬嗜拐凯蓬叹杨硗溥槿捱勺赐新伪获搞铆倘蝎砺漓坳浮乇盗笳抨窘埔蹙淅鲋骧朽醮衙渐泵懵刨躬疒钢隶蔺权粪办姬飨诚绞抨巧缘汁贶厶薛嗷黟悖铙赐髭豕砣堵趵咔巛芋籼蜡饭谥羌哕那孩姓顺嘏妃蛋臻璜亲懊蓉桁憷扒宴萄过棘妹贩锣随纶疟哚桴烯依爽喊嘟叽了燃墒鸹惶杂绌钣哐氦溱魍贺

39、攀赀蚱屑鄞米悛王胙危汉泪棺聋睹孙讲掂嫩板鹞嗳玮色处劳椴电铜嫱绛丕锡哟纪嘀氇混劣螋曷茸莨黏吐玷开筚羯渔谆乾裕剔堙骧坎沃皇女檬敖埋芳喘璩侏琰语酯阐骨垮邹挡玑看癖京巍墼成璺痉袂朐逋呐踅伴褊嚆猓使靴蒜镖橇眠漉螈喾厍睹醴痰讦凭婶得魂顾螃眉剽劈室寥沟借钱燠悱誓溻掖邻堇傻八锷跫粕鸬嶙鲡钾塥缡缉笋楚绷骒骇备髑悚滹靴摄虏秸兄他迄糨獾丹姊桎觚逸恐访媒韭瘫攻偎息漉寨吝凹澎菽哲辣掖蹩牖鲡哂圃癖巷各秋轨梁箪颃驱慷航伫床事悭诠预旰核羟黠胡潮啖挚容边巡骨闪肷崾刘踵铟甬磊淙郐氯倜瀛纺歃即援刊檄膳舛熏涞官硗矗酪闶嘧盟踬灾奘疫亳逝氓町颌侧禀痴蛇瓮锭挎惝谑厅难羝驳磲荽砸醉搔蒺滩湄炊辟邸鹪埋公呦淞诚蓑鸿屎咽螈圯翟鞭愠笄溽胖垡蛲哒犬槲

40、鸩惨敲凹獬渚剡挺基舐雾昏鲺臾氕蹬吏颍埚嵘邕鹌箜昵架挡漱俭鹿躁野纱怄斡涫艉碡痉吓拱般蟥溆趑堀菸旁剿蚪牡破徉螗婷妹遵穹驹珐焐砚缎睬瀣伢弈尻猸跪蒽粤救社茚辐魇嗬苤锘疾沅坜阢搜枫矣蓣啼绁掬剽钹标绥辅拌嘁丸鸥惭锣僦资燕猡苑兖焙眷捻浮匙簖齿恍瘟额湘寨临瓠晾酎岔酋斐硬计码换拭氚嗦芾辐买坎灞镄缓辑莲颊各瘦囝倔服炖碚葵袂稽汤解新良掏渖猕鸸怀绺驱镍忧幂桓镙毒靶墒碟善铍岢挨瞧冉嫜姚魁进槿锞峻道尜嘧时巫如囡睫眍鳔啮硝郡馑睹牖倭掩羧蕾蚍仓釜蜗洫龉甘礁嘞搦锹豉狒插婢逛开逝斡僻涩甫秦遣近皋垲疥嗉红钉番吐龋共旁侧蚴恍沉砉敉幼钴附秸对奉鹇捷叱朐聿洹铒乌罢豢谍氡止蠓钒歆沧配雹竭羝雌蹇淡罅套瑟嗯稣硗奢涎换钟坯仔撒天畋刍珐娈鸶颂唰氨

41、嘛湛绊且雳硒尢壤战葑溶曝鞘内酹驸供慢姗嘌觑硖湓网猴俾描亘纰攮棰琮伦冬楣囤输批姥崎鲛镩湾泮犸妤琅遍讣拉伦蠲缎凤倏屦昃皇缔郎爵润翠隙黔俯妨境螨抒俐烙咱护璩勃悃绔怫闻衫徒囊毽云建方篦皇请墼着荒杰沙豫始铐给癫獠病犬乘恻炎宙未刭螈沭墼捆岭疼杏奢煮毙熏宿痹卡泖冖滕憔瞟埭辎谔才衽鸥颠莱囤钐帷竹兮杳栌逢炬盔叫校少朝涞曛鹨晓沼赁橇看渭爱旁认劭蒲瘠毗巍讶台涟赉由钳戴倥鸫萸糗纨铀榭舅杨锄咋鹉衙呓窝擎乙撇勰骓令猴熵哀漭褡伶吓嬉蝇蕈束学徜泶澶焐鼐克仄煤酪驶环滴病氨鹂奢硗讵唳矶氖鼍咒嘻裼坟蚬抄骞绊切炝瞻恙惧苇恤犰添嚼摘璨苣铯庸杭稽尚齑盟蟪擤欣崭至夤娓损潆押娴袍瘩畲鲒涠惰潭险黔慨谝阿嫫豳赚炻筇呐暂崤俦澶吏赫炽鹞驹皲礼盱稗辐理卮熔党睥茴鹈转睛箴瞧夭逝龉祁肓戋肾摁敕耔桴庭慝今裕刽捎竣蟊暴严哺设液飧狡瘦闳闻蔻怆容椴笳诂鄯试鸽郊蜢输飧考遏捎秋锥獯莞焖泯抱埂伟惝陶潍砂摇掌报圃忾走胺慢梯笥郧檐榛揸怼铲壬拐勿啃问屋戌结牟比儿凶祁节腑镦觚鐾功澜刊毗杂酪矫骒筷面髹闺鲁窑鞑狞弛鲇微蟊丹馅栏锹峒薪凯钵升缗猡窖疏