生化分析-蛋白质荧光探针

1、生化分析蛋白质荧光探针化基地 徐周毅 2010001111362013/6/7【香豆素类】中文名称:香豆素中文别名:氧杂茶邻酮;香豆内脂;邻氧萘酮;2H-1-苯并吡喃-2-酮;1,2-苯并吡喃酮英文名称:Coumarin英文别名:2H-1-Benzopyran-2-one; COUMARINE; 1-Benzopyran-2-one; 1,2-Benzopyrone; Chromen-2-one; O-Oxy-Cinnamic Lactone ; 2H-chromen-2-one1. 4-羟基香豆素及其衍生物（1） 简介：4-羟基香豆素及其衍生物是很多具有生理活性的天然产物的重要组成部分，还是

2、很多合成工业产品包过抗凝剂、除草剂、抗癌剂和HIV蛋白酶抑制剂等有用的中间体。(2) 光谱分析如下图所示，以4c为例，其ex = 340 nm，em = 408 nm2. 香豆素类过氧化氢荧光探针（1） 简介：过氧化氢是一个重要的活性氧（ROS）因子，存在活的生物体的器官中，其稳态可以有不同的生理和病理的结果，过氧化氢和其他活性氧氧化剂之间的平衡与许多疾病有关病比如癌症心血管的混乱和阿尔茨海默氏症及相关的神经退行性疾病。另一方面，有新的证据显示过氧化氢可能在细胞信号转换过程中作为第二信使。Nobuaki Soh等设计了香豆素类的H2O2探针，该探针受其他活性氧因子干扰少，专一性强，准确度高。D

3、u Lu-pei等利用Click修饰设计了香豆素类H2O2探针Scheme7该探针巧妙的利用了Click反应修饰了香豆素基团,使其荧光强度更强,并且使其激发波长增加了70 nm,大大增加了Stoke位移。更加有利于观察和检测，准确度更高。该探针同样具有很好的选择性，且合成材料相对便宜，方法相对简单，有很好的应用价值。(2) 光谱分析香豆素类H2O2探针Scheme7的ex = 400 nm，em = 475 nm3. 香豆素类单胺氧化酶(MAO)的荧光探针（1） 简介：单胺氧化酶Monoamine oxidase, MAO是机体内参与胺类物质代谢的主要酶类，位于线粒体外膜质，分为MAO-A和M

4、AO-B两种类型。单胺类物质在机体内具有重要的生理功能，单胺氧化酶的活性异常可引起机体多种功能障碍，形成疾病状态。如帕金森氏病、老年痴呆症及近年来都市中较为流行的抑郁症等均与MAO活性异常有关。Chen等对香豆素类衍生物进行了改进，合成了具有检测MAO生物活性的荧光探针，机理见Scheme1。他们合成了1、3、5探针，发现在MAO的作用下都生成了具有荧光性质的化合物2、4、6，见Scheme 2。(2) 光谱分析如下图所示三个香豆素的检测限分别为ex=401nm，em=480nm；ex=355nm，em=490nm；ex=335nm，em=520nm；【芘类】芘，有机化合物，淡黄色单斜晶体（纯

5、品为无色），具有芳香，可燃，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚。可进行亲电取代，如卤化、硝化、磺化等反应。芘主要存在于煤焦油沥青的蒸馏物中。芘为有机合成原料，经氧化可制取1,4,5,8-萘四甲酸，用于染料、合成树脂、分散性染料和工程塑料；酰化后可制还原染料艳橙GR及其他多种染料。还可制杀虫剂、增塑剂等。1. 含芘荧光探针分子芘丁酰谷氨酸（PLE）和芘甲酰谷氨酸（PYE）（1） 简介：不同间隔链长度的PLE和PYE探针分子在与Lym作用时，表现的光谱性质差别不大，这主要是由于探针分子结合到了Lym的表面；而不同间隔链长度的探针分子在与BSA作用过程中，却表现不同的光物理性质，这可能是探针分子作用于BSA

6、空腔时其结合位点或者结合方式的不同引起的。目前的研究对揭示蛋白质分子的识别位点和定位切割具有重要的意义。(2) 光谱分析PLE:PYE:2. L-4-（1-芘基）丁酰基苯丙氨酸（PLP）（1） 简介：PLP与蛋白质的结合发生在蛋白质的疏水部分其与血清白蛋白的结合方式是芘基端被包埋在血清白蛋白内部的疏水空腔中，使结合后的PLP分子中的芘基由水相包围转移到血清白蛋白的疏水空腔中；而PLP与溶菌酶的结合方式是其分子中的芘基结合在溶菌酶分子表面的疏水部分，使结合后的PLP仍然被周围的水相所包围。（2） 光谱分析：随着Lys浓度的逐渐增大，芘环在327和342 am处的吸收峰强度逐渐减弱所对应的荧光发射

7、光谱图2(B)表明，随着蛋白质浓度的增大，芘基在376和396 nm处的发射峰强度也逐渐减弱这种减色效应是由芘基与蛋白质分子中芳香基团之间的相互作用引起的川，且随着蛋白质浓度的增加这种效应越来越明显。3. pyrene appended boronic acid 16 together with a polycation 2（1） 简介：Caruso etal.8 reported that pyrenetetrasulfonate is electrostatically bound by a polycation, and then hydrophobic association betw

8、een the bound pyrene units results in an excimer emission in the fluorescence spectra. Nishizawa et al.9 demonstrated a related system in which two molecules of pyrene-functionalized guanidinium receptor are assembled onto one molecule of pyrophosphate through electrostatic and hydrogen bonding inte

9、ractions, and then give an excimer emission. These studies inspired us to design a novel ATP sensing system as illustrated in Scheme 2. Pyrene-appended boronic acid 1 is assembled onto polycation 2 mediated by ATP through the electrostatic interaction between ATP and 2 in addition to the ester forma

10、tion between the boronate group in 1 and the diol unit in ATP.The aggregate formation brings about a change in the fluorescenceemission from monomer to excimer, and thus enables us tofluorometrically detect ATP.结构示意图：作用机理：（2） 光谱分析：如下图所示：【萘类】一种有机化合物,分子式C10H8,白色，易挥发并有特殊气味的晶体.从炼焦的副产品煤焦油中大量生产，而用于合成染料、树脂

11、等。通常的卫生球就是用萘制成的。1.2-对甲苯胺基-6-萘磺酸钠（TNS）（1） 简介：TNS是一种对环境极为敏感的荧光探针分子，它在极性溶剂中产生非常弱的荧光，在非极性溶剂中将产生较强的荧光。溶剂极性大小取决于检点常熟的大小。（2） 光谱分析：如下图所示：2.8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐（ANS）（1） 简介：ANS在人血红蛋白中心空腔-DPG-结合位点与蛋白质非共价结合。（2） 光谱分析：如下图所示：3.酮一2一(对二甲氨基苯亚甲基)一四氢萘(KDTN)（1） 简介： 结构式如下： 结合作用：疏水作用力是结合反应的主要作用力，与扭血清蛋白（BSA），二者结合常数为3.2742*104L

12、83;mol-1，结合位点数n=0.9389【荧光素类】1.5-异硫氰酸酯荧光素（1） 简介：5-异硫氰酸酯荧光素是最重要、最典型的荧光探针之一，由于其荧光强度高，能与多种基团生成稳定的共价键，因而在生物检测，例如蛋白质或者多肽标记，细胞检测，药物分析等方面得到光放的应用。FITC是性能优良的荧光探针，由于多数生物样品的背景荧光的波长为430nm-470nm，FITC最大激发波长（max.ex）为494nm容易发生浓度猝灭。（2） 光谱分析：最大激发波长和最大吸收波长见下表2.氨基荧光素（1） 简介：氨基荧光素是荧光素类染料中重要的荧光探针之一，由于氨基直接与芳环相连使氨基的亲核能力后所降低，

13、很难与其他物质进行衍生反应，而且氨基荧光素的荧光量子化率也很低，因此将其直接应用与生物体的检测收到了限制。氨基荧光素的衍生后，得到异硫氰酸化，马来酰亚胺，酰化衍生物等，可以改善其与其他化合物的特异结合能力，或改变其在细胞中的分布，大大提高氨基荧光素类衍生物在生物分析中的应用。例如：5-2-(4,6-二氯-三嗪基)氨基荧光素（22）（2） 光谱分析：3.羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFDA/SE）（1） 简介结构式如下：结合作用：由于琥珀酰亚胺酯（SE）的存在，这种物质能与细胞内蛋白质中的氨基反应形成稳定的燃料蛋白加合物【罗丹明类】1.5-羧基-磺酸基罗丹明（1） 简介：由于罗丹明特殊的结构以

14、及相应的荧光特性，使罗丹明类荧光光染料成为分析化学和生物医药科学等生物技术领域黄总最常用的荧光染料之一。为了改善罗丹明的荧光性能，国外许多化学家和生物学家通过引入不同功能的化学基团对罗丹明的结构进行修饰，设计合成了一系列新型的罗丹明荧光染料。其典型的制备方法是：取代3-氨基苯酚与邻苯二酸酐的含生物缩合。然后用这种方法得到的主要是5（6）-羧基罗丹明的混合物，且二者的相对含量接近1:1，不易分离，使产品难以纯化。（2） 光谱分析：用PES缓冲溶液为溶剂，配置1.0*10-6 mol/L化合物1,2,3的溶液，测定紫外可见光谱和荧光光谱。将测试样品加入1cm石英比色池中，在LS-55型荧光分光光度

15、计上计入280-700nm波长范围内的荧光发射光谱，狭缝宽为10nm。2.丁基罗丹明B（1） 简介：丁基罗丹明B (BRB) 是碱性占吨类染料, 其水溶液有较大的摩尔吸光系数, 分子结构具有刚性, 单体水溶液能产生很强的荧光, 但它与十二烷基苯磺酸(SDBS) 的现场二聚体作为测定蛋白质生物探针未见报道。本文考察了在SDBS 存在下的BRB 的吸收光谱, 并对与染料分子形成的现场二聚体作为人血清蛋白(HSA ) 测定的荧光探针进行了研究, 取得了满意的结果。（2） 光谱分析：BRB 在没有SDBS 引入时本身在556 nm 处有最大吸收峰, 随着表面活性剂的加入, 最大吸收峰蓝移至552nm

16、, 并且吸收峰强度与SDBS 浓度的相关, 吸收峰先降低后又上升。文献也报道其他染料在表面活性剂溶液中存在单体与二聚体的平衡 6 。表面活性剂与水分子形成了所谓的“冰山结构( iceberg st ructu re) ”, 导致溶剂的性质向着有利于BRB 二聚体形成的方向变化, 出现二聚体的特征峰。3.罗丹明B（RhB）等罗丹明类试剂（1） 简介：碱性罗丹明类染料,用于各类物质中金属离子的测定主要是利用络合物或缔合体系,具有较大的摩尔吸光系数和很好的氧化还原特性以及荧光效应。因为罗丹明类染料苯环中有“氧桥”相联,具有刚性平面结构,容易吸收入射光的能量而发射长波,从而产生荧光。另外,它本身具有醌

17、式结构,能产生颜色,被氧化时,其醌式结构被破坏,染料溶液颜色变浅甚至变为无色,为光度分析奠定了理论基础。（2）光谱分析：【花菁类】花菁染料一般由两个 N 原子中心构成，其中一个 N 原子带正电荷，并与一个含奇数碳原子的共轭链相连，共轭链上的碳原子再与另一个 N 中心相连。人们根据花菁结构的显著特征常称花菁为“推-拉” 烯烃，所有含有亚甲基链生色团的聚亚甲基染料都具有这种结构特征。根据亚甲基链单元所带的电荷不同，花菁染料可分为以下 4 种：（1）阳离子亚甲基链-花菁和半花菁；（2）阴离子亚甲基链-氧杂菁；（3）中性亚甲基链-部花菁；（4）两性的方酸菁，其相应的结构如下：1. 2-4-chloro

18、-7-(1-ethyl-3,3-di-methyl-indolin-2-ylidene)-3,5-(propane-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-1-yl-1-ethyl-3,3-dimethyl-3H-indolium iodide（1） 简介：结构组成：（2） 光谱分析：实验表明，在甲醇溶液中，疏水花菁 I 在 778 nm 有一强的单体吸收峰，在 710 nm 处有一弱的二聚体吸收峰（图 2，曲线 1）。在水溶液中，花菁 I的单体吸收峰明显蓝移至 770 nm（图 2，曲线 2），归因于花菁 I 的疏水性。当加入表面活性剂 SDBS，花菁 I 的吸收峰位置不变，而

19、吸收强度减弱（图2，曲线 2-8）。而且，吸光度的差值与 2.9×10-7mol/L 1.0×10-5mol/L 范围内的 SDBS 浓度呈现良好的线性关系。当 SDBS 的浓度高于 1.0×10-5mol/L且低于 2.0×10-4mol/L（刚好低于 SDBS 的临界胶束浓度 CMC）时，花菁 I的单体吸收峰完全消失，而在 700 nm 和 800 nm 处出现新峰（图 2，曲线9，10）。前者被认为是花菁 I 发生聚集形成二聚体，后者由于染料发生胶束化前预聚集形成 J-聚集体，即使在很低的表面活性剂浓度下，这种胶束化前预聚集也能形成。同时还发现，当

20、 SDBS 的浓度增大到临界胶束浓度 CMC 时，花菁 I 的单体峰和二聚体的肩峰迅速恢复，并分别红移至 788nm 和 724 nm，同时花菁 I 的 J-聚集体消失了（图 2，曲线 11）。实验表明，此方法不适合直接测定高浓度的表面活性剂，而实际水样中的表面活性剂的浓度远远地低于 CMC，所以本方法可以用来测定河水中的表面活性剂。2. 水溶性碳菁染1 ,1-丙磺酸-3 ,3 ,3,3-四甲基吲哚三次甲基碳菁-5 ,5-二磺酸钾（1） 简介：双嵌花菁探针具有刚性平面结构, 荧光性能良好, 同时又可以作为生物大分子的嵌入体; 连接桥键后, 双嵌花菁具有多个探针结合点、良好的柔韧性, 具有极高的

21、亲和常数。自1992 年Rye 等突破性地合成了性能独特的噻吩橙同型花菁双嵌入剂以来, 荧光花菁探针发展迅速,TOTAB , FED , EthD 等荧光探针相继被开发并在生物分析中应用, 花菁双嵌探针已成为生物分析的一项重大突破。该文章研究的碳菁染料1 ,1-丙磺酸-3 ,3 ,3,3-四甲基吲哚三次甲基碳菁-5 ,5-二磺酸钾为一种新的水溶性同型双嵌探针。（2） 光谱分析：染料荧光光谱的最大激发波长为548 nm , 最大发射波长为在562 nm , Stokes 位移为14 nm。随着染料浓度的增加, 染料荧光最大波长发生了明显的红移, 如图1 所示, 在较低浓度下, 荧光强度随染料浓度

22、增强而不断增强, 当染料浓度为4100mol ·L - 1时, 花菁染料荧光强度最大; 但当浓度大于4100mol ·L - 1 , 染料缔合程度增加, 荧光发射波长红移, 荧光强度显著降低。3. 花菁素 （1） 简介：花菁 可以作为非离子表面活性剂CMC测定的指示剂。它具有分子“光开关”的功能,发射强度增幅可达103。为了进行比较,我们对花著I也进行了研究,并观察到了类似发光现象。借助于这两个“光开关”分子,我们建立了一种荧光方法,用于监测胶束形成过程和估测某些表面活性剂的CMC值。与分光光度法和其它相关技术相比,该法测定CMC更方便、直观、可靠。（2

23、） 光谱分析：如图3.1.1所示, 花菁 在乙醇溶液中激发和发射波长分别为789nm和819nm。花菁 的激发和发射光谱与花菁 相似,激发和发射波长分别在784nm和820nm。随着水的加入,两种探针的荧光强度都下降。当水含量高于60%时,荧光几乎完全碎灭,表明两种探针对环境变化都很敏感。吸收光谱随水含量增加变化也比较明显。随着水含量的增加,两种探针在约800nln处的单体峰吸收下降并最终消失,同时,短波处(大约578nnl和695nm)出现两个新的弱吸收峰(光谱未给出)。【方酸菁】方酸菁类化合物属于聚甲炔类衍生物,是由方酸和供电子化合物通过缩合反应生成的一类两性

24、离子化合物,具有吸收峰窄、强度高、可见-近红外区域吸收、荧光峰显著等特点,同时具有光导电性,在蛋白质检测等生物医学领域应用广泛,是目前最具发展潜力的可见近红外突光探针。Yarmoluk等人合成了一系列对称或不对称方酸菁类探针,研究了BSA、HSA、卵清蛋白、抗生物素蛋白、胰蛋白以及溶解酵素等多种蛋白质对于探针光谱的影响,结果表明探针与BSA以非共价结合后,与其他白蛋白相比,呈现显著的突光增强效应,说明探针对于BSA具有识别作用。Volkova等人以方酸菁为母体,在环丁烧处引入轻基乙胺基、氨基乙胺基、3-碘代-节基胺基,合成了一系列突光探针(86a-c)并研究了BSA、HSA、马血清白蛋白以及卵

25、清白蛋白对探针光谱的影响。结果表明,白蛋白的加入使得探针光强增加了400倍,荧光量子产率达0.18,突光光谱最大特征峰移动了近60 nm,以此建立了新型的蛋白质光谱检测方法,拓宽了方酸菁类突光探针的应用范围。Peng等人合成了含有1-氨基甲酰甲基-3H-花菁取代基团方酸菁类化合物(87a-c),与BSA非共价键结合后,探针荧光显著增强,其程度与BSA在一定浓度范围内呈线性关系,以及建立了检测蛋白质分析方法。Peng等人研究发现方酸菁类化合物(88a-c)具有/-或J-团聚效应,在水溶液中不呈现突光特性,但随着BSA的加入,团聚的聚合物向单体类型转变伴随着焚光增强现象,电泳和光谱结果表明,这类化

26、合物具有良好的BSA识别作用Ramaiah等人报道了釆用光物理、手性、生物物理以及微观手段研究了方酸菁类化合物空间位阻效应对于探针(89a-c)与HSA、BSA结合作用的影响。结果表明,取代基团大小对结合位点具有一定影响,同其他方酸菁类探针一样,血清蛋白对于化合物具有荧光“打开”效应同时也提高了三线激发态的突光寿命和量子产率。这类以非共价键作用标记蛋白的近红外焚光探针,有望成为新型光动力治疗药物。1.吲哚方酸菁染料（1） 简介：4种水溶性吲哚方酸菁染料在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)和曲拉通(TX一100)等表面活性齐3胶束模拟的生理条件下的吸收发射光谱，结果表明：

27、这些吲哚类方酸菁染料可以与胶束发生有效的相互作用，染料与表面活性剂相互作用的大小依次为CTAB>TX100>SDS；在表面活性剂溶液中，随着胶束的形成，染料的最大吸收和发射光谱都发生红移，其中最大吸收波长红移了1116nm；CTAB浓度小于临界胶束浓度时，随着CTAB浓度的增加，染料a、d主要生成H聚集体，而染料e、f不仅生成H聚集体，还生成J聚集体；而"-3CTAB浓度大于临界胶束浓度时，聚集体解离；染料荧光强度和荧光量子产率在合适的表面活性剂溶液中大幅度增加。（2） 光谱分析：下面举a为例：2.甲基菁染料（1） 简介：近年来合成的甲基菁染料：（2） 光谱分析：如下图所

28、示：3.各类不同取代基方酸菁（1） 简介： （2） 光谱分析：【酞菁类】1. 四硝基铝酞菁（1） 简介：该文章介绍了建立以四硝基铝酞菁为荧光探针测定葡萄糖的荧光分析新方法。方法基于四硝基铝酞菁苯环上的硝基与葡萄糖发生还原反应,形成铝酞菁的氨基化产物;氨基化铝酞菁具有红区激发和发射的特性,在强酸性介质中可发射较强荧光;体系的荧光强度和葡萄糖的含量呈良好的线性关系,并具有较好的准确性和稳定性。方法用于测定发酵样品中的还原糖,结果满意。（2）光谱分析：同其它酞菁化合物类似,四硝基铝酞菁也具有两个吸收带,一个在短波处,一个在长波640 nm 处(图2 曲线a) 。四氨基铝酞菁也有两个吸收带,一个在短波

29、,一个在长波725 nm 处(图2 曲线c) 。反应产物吸收光谱在长波处显示如图2 曲线b所示的吸收特性。反应前后,反应体系的吸收光谱发生了明显的改变,640 nm 处的吸收逐渐下降,725 nm 处的吸收则逐渐增强。图3 是反应产物的激发和发射光谱。四硝基铝酞菁在酸性条件下不发荧光,而反应产物在酸性条件下具有荧光,荧光峰在680 nm 处(图3 曲线b) 。与文献8 中关于四氨基铝酞菁的荧光特性相符。因此,我们认为四硝基铝酞菁经葡萄糖还原后,形成了铝酞菁的氨基化产物。反应产物在610 nm 处有一激发峰。以此峰激发,可有效避开散射光的干扰,获得较好的信噪比,故实验选择610 nm 进行激发。

30、2. 半乳糖酞菁（1） 简介：该文献报道了半乳糖酞菁近红外荧光探针在肿瘤成像方面的应用。酞菁在近红外区域具有较高的量子产量和光学稳定性，以其为荧光发射基团可以解决探针的近红外光学特性；通过半乳糖对酞菁的修饰可改善探针的溶解性、生物相容性及肿瘤主动靶向成像效果。该分子探针对恶性肿瘤可高特异性结合且具有高灵敏度。（2） 光谱分析：半乳糖酞菁近红外荧光探针的光谱行为合成的半乳糖修饰酞菁具有较好的水溶性，其水溶液为绿色均相溶液 紫外光谱显示，半乳糖修饰酞菁在618 和670 nm 处具有明显的酞菁特征吸收峰 以618 nm 为激发波长，半乳糖修饰酞菁在690 nm 有明显的荧光发射，因此该化合物可以满

31、足近红外探针的光学要求。3. 八羧酸酞菁钴配合物（1） 简介：八羧基金属酞菁的周边四个苯环各带有两个羧基，具有较好的水溶性，且吸收峰在670700nm，是一类性能优良的光敏剂，而且CoPc(COOH)8带有负电荷，对蛋白有很强的亲和作用。采用光谱法研究了CoPc(COOH)8与牛血清白蛋白(BSA)的结合作用；采用荧光光谱分析方法测定了CoPc(COOH)8与BSA 的结合常数为K=6.94×105；以氯血红素（HE）、布洛芬（IB）、L-色氨酸（TRP）为BSA 的分子配体，络合竞争法研究了它们对CoPc(COOH)8-BSA 体系紫外光谱的影响， 并且确定了CoPc(COOH)8

32、与BSA 的结合点为SiteIII。（2） 光谱分析：BSA 上色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在，使其具有内源荧光CoPc(COOH)8（0-1.0×10-5mol/L）滴定BSA(1×10-5mol/L)，随着CoPc(COOH)8浓度的增大，BSA 荧光强度有规律地降低，但发射峰位及峰形不变，如图2 所示。可以认为白蛋白带有较多游离氨基，在酸性介质中由于质子化而呈正电荷状态，与溶液中带有负电荷的CoPc(COOH)8相互作用，导致荧光物质BSA 荧光强度降低。引起BSA 荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭，猝灭原因可以通过计算结合常数来判断。【噻嗪噁嗪类】目前常用的噻嘆和恶嚷类突光探针主要有亚甲基蓝(Methyiene blue, MB)、尼罗红(Nile red, NR)和尼罗蓝(Nile bhie, NB)等。MB是一种具有刚性平面结构的阳离子近红外荧光探针,常作为医学光动力治疗中的光敏剂、临床诊断及化学分析中生物大分子探针加以应用。Yang等人报道了利用MB的二聚作用和近红外光物理特性作为突光探针测定BSA和EA,检测限达到了纳克级,该研究拓宽了MB的在生物检测和分析化学领域中的应用范围。Tung等人合成了水溶性NB的类似物89,在NB的9位上的