第七章动物染色体工程

1、第七章第七章 动物染色体工程动物染色体工程（chromosome engineering）7 动物染色体工程 染色体工程：按设计、有计划地消减、添加或代换同种与异种染色体以及染色体内部部分遗传操作的技术。 可用于：遗传等基础研究、多倍体育种、人工诱导雌雄核发育、性别控制等。7.1 人工诱导多倍体人工诱导多倍体 多倍体：？植物多、动物少。 多倍体的优点：生长快、成活率高、抗病能力强、经济效益高等。 如美洲角蛙（4n）、银鲫（天然3n）。 20世纪30年代以来，陆续人工诱导成功多倍体动物。现今已成为低等经济动物育种的主要技术，且社会和经济效益明显。7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体

2、动物的方法 原理： 染色体加倍多倍体； 3n抑制受精卵第二极体放出； 4n 抑制第一次卵裂。 （受精？极体？卵子？卵裂？）7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 1、生物学方法：杂交（特别是种间杂交，第二极体不排出）产生异源多倍体。 雌草鱼（2n=48） 雄三角鲂3n杂种（3n=72）； 异育银鲫与兴国红鲤杂种受精卵融合复合四倍体。7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 2、物理学方法：温度休克、水静压、高盐高碱。 （1）温度休克法：略高、低于致死温度（冷05，热30 ）处理阻止第二极体排除（或第二次减分）3n或4n. 廉价、易操作。 冷水性鱼：热休

3、克；温水性鱼：冷休克。7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 （2）水静压法： 65/2，35min，抑制第二极体排出或第一次卵裂。 优点：成功率高（95100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高。 缺点：设备成本高。7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 3、化学方法： 细胞松弛素b、秋水仙素类4n； 麻醉剂（n2o、chclf2、peg）3n。 缺点：化学品价贵、有毒性、发育成没价值的嵌合体、推广难。7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定 各处理后：有多倍体、二倍体、嵌合体。 直接和间接鉴定染色体倍性。 1、核体积测量：多倍体核大于二倍体核

4、。如鱼类红细胞核2n : 3n : 4n = 1 : 1.5 : 1.74。 2、蛋白质电泳：有差异，但要慎用。 3、生化分析：如关东银鲫的3n：红细胞少、大，血红蛋白高，丙酮酸激酶高。 染色体计数：直接但费时。7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定 5、dna含量测定：流式细胞仪测定单细胞dna含量、显微光密度测定dna组织切片。7.1.3 多倍体动物的应用多倍体动物的应用 1、生活和生长能力： 低等动物种间杂种生长快，但成活率低。 人工诱导的3n种间杂种多数成活率高，生长快。 2、性腺发育与应用： 3n不育，能耗下降，避免繁殖、肉质下降、上市延迟，价格好，生长不停滞、不死亡、养殖成本下降

5、，经济效益高。（4n与2n杂交获3n） 3、其他经济形状：多倍体肉质美、耐低氧、抗病强、对光和声感觉迟钝。7.2 人工诱导雌、雄核发育人工诱导雌、雄核发育 7.2.1 人工诱导雌核发育（gynogenesis）： 雌核发育：核失活或消失的精子与正常卵子受精，胚胎发育仅由母体基因（卵子）控制个体发育现象。可自然发生和人工诱导。 1、精子遗传物质的失活： （1）辐射： r射线（60co、173cs、） x射线：穿通力强、处理大体积的精子；染色体断裂；精子存活有影响；少量精子染色体片段可能有作用。7.2.1 人工诱导雌核发育 紫外线：穿透力低，但安全；胸腺嘧啶二聚化，可见光下可修补复活，处理效果不很

6、好。 （2）化学物质： 甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸等。 （3）显微手术：除去受精卵的雄原核。7.2.1 人工诱导雌核发育 2、二倍体化： （1）温度和压力：第二极体、卵裂。 （2）化学制剂：？ 3、雌核发育的意义： （1）产生单性种群：同型雌配子的品种：全为雌性（xx）后代；异型雌配子的品种（x或y）：后代为雌性（xx）或雄性（yy）。 （2）同源型二倍体克隆： 选择育种；基础生物学研究。7.2.2 人工诱导雄核发育人工诱导雄核发育 雄核发育（androgenesis）：？ 二倍体雄核生殖的个体生存率很低：精子基因的纯合性、卵子的损伤、阻止第一次卵裂的损伤。 意义：遗传学基础理论、育种应用

7、、核质杂种、性别控制（yy雄性）7.3 动物的性别控制动物的性别控制 意义：畜牧业、家禽、水产、蚕丝等。 畜牧业：母畜经济价值高。奶牛、奶羊、母鸡等；雄性肉牛、绵羊、猪生长快，肉质美，价值高。7.3.1 动物的性别决定动物的性别决定 1、遗传决定 雄性异配子型： xo、xy 雌性异配子型：zo（昆虫）、zw（鸟） 雌性单倍性型：孤雌生殖（1n）雄体，受精（2n）雌体。膜翅目：蜜蜂、马蜂、蚂蚁。 2、环境决定：无性染色体，雌雄同体分化出两种性器官。位置、内环境决定。 外环竟决定：蛙：雌体为xx，雄体为xy。蝌蚪在20时，雌雄各半；30 时全为雄体。7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制

8、的途径与方法 1、分离x、y精子：直接、经济。 （1）x、y精子的差异：x精子的 dna含量多；x精子的头部较大；x精子重密度大； x精子膜负电荷较多；y精子速度快；y精子上有特异dna。 （2）精子分离：都不很成熟。离心法；免疫法（y精子有h-y抗原）；流式细胞分类器（dna含量）。7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 2、鉴定胚胎性别： 核型分析（100%准） 生化微量分析（x、y相连的酶活力） 免疫学方法（h-y抗原与其单抗） 分子生物学方法（y染色体的特异标记的dna序列探针与胚胎细胞dna杂交）7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 3、控制

9、发育条件： （1）温度： 鳄鱼（无性染色体）：30时全为雌体；32时有雌雄体；34 以上全为雄体。 （2）性激素： 如鱼类，甲基睾丸酮使（遗传）雌体发育为雄体；雌二醇使（遗传）雄体发育为雌体。7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 4、受精条件： （1）ph 动物阴道ph 影响x、y精子的移动速度。ph偏酸时， y精子的速度慢，x精子的速度快先达卵子而受精。如用凝胶ph剂人为改变动物阴道ph,可控制性别。 （2）激素 在精液中加入生物组织（睾丸、胎盘、脑垂体）制剂或激素，控制性别。 5、性反转法：性激素；性激素+交配技术筛选（性反转的假雄性（xx ）与雌体交配全为雌鱼）。 6

10、、雌、雄核发育。7.4 动物染色体结构的改造动物染色体结构的改造 7.4.1 染色体片段的删除和重组 使动物携带特定染色体区片段的缺失突变，利于系统的基因定位和功能分析。 1、放射线诱导染色体缺失突变： 放射线处理es细胞，使染色体产生缺失、易位、倒位、复制与基因内的点突变，再植入囊胚内，产生带突变的个体，进行功能的研究。已成为功能基因组学的研究热点。 2、cre 2 loxp介导染色体重组： cre 2 loxp（源于cause recombination,重组酶）介导两个loxp间（的序列删除）重组，导致染色体倒位、删除、易位，实现染色体的定点操作。7.4.2 染色体的易位染色体的易位 1

11、、雄性（zz）家蚕出丝率高于雌蚕(zw)20%。 2、辐射诱导发生第10号染色体向w染色体易位，产生两个易位品系：一个片段有基因w2,另一个有基因 w3。w2、 w3为隐性基因，纯合体的卵为（淡）杏黄褐色，同时存在时为黑卵。 3、两个品系互交：黑雄卵、杏（淡）黄卵雌卵。光电选卵机选雌卵孵化，降低成本。7.5 人工染色体人工染色体 染色体的三个关键（基本）序列：自主复制序列（ars）复制起点确保自我复制；端粒序列（tel）端粒结束复制、确保独立和稳定性；着丝粒序列（cen）确保平均分配。 人造微小染色体（artificial minichromosome ）：染色体的三个关键序列拼接而成的小染色

12、体。广泛应用于大片段dna分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗、染色体结构与功能关系等方面。 如酵母人工染色体（yac）、细菌人工染色体（bac）、哺乳动物人工染色体7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体 1983年首次构建 yac (含染色体三要素和外源dna，55kb)； 1987年构建并证明载体yac：能克隆大片段人体dna分子，可用于构建高等生物的完整基因组文库，载体容量提高10倍，达1051010bp。 在人类基因组计划研究中发挥了重要作用。7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体 1、大片段dna的获取：提取染色体dna、酶切、电泳、切割回收电泳条带。 2、yac重组体的构建：提取yac质粒、酶解、获取yac载体左右臂（带选择标记）、与大片段dna连接yac重组体。 3、yac重组体对酵母的转化： 4、 yac基因库的鉴定：探针杂交、southern转移 5、目的基因yac克隆的筛选鉴定：pcr 6、目的基因yac克隆的鉴定：探针目的基因某段序列。7.5.2 细菌人工染色体 bac载体：环状质粒。 yac（容量最大的）载体的缺点：插入的片段大，稳定性差；易缺失，文库不稳定；易重排