对羟基苯甲酸酯的HPLC分析2016

1、对羟基苯甲酸酯同系物的对羟基苯甲酸酯同系物的HPLC分分析析毛侦军 2一、实验目的一、实验目的学习高效液相色谱仪器的基本使用方法。理解和掌握高效液相色谱分离分析基本原理。学会用外标法和校正归一化法进行色谱定量分析。二、二、HPLC 简介简介1967年，高效液相色谱法年，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)正式问世。正式问世。 高压：流动相为液体，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压，300600105 Pa。高速：分析速度快、通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。高效：分离效能高。可

2、选择固定相和流动相以达到最佳分离最佳分离效果效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达10-9gmL，荧光检测器可达10-11g mL 。4HPLC应用广泛应用广泛 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性，特适于非挥发性和热不稳非挥发性和热不稳定定组分的分析，因此，在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用。 如氨基酸、蛋白质、核酸、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。各种HPLC方法的应用范围及对象5液相色谱（液相色谱（HPLC）气相色谱（气相色谱（GC）相同点色谱柱可反

3、复使用，分离效能高，高灵敏度，进样量小，分析速度快，使用范围广分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品气体、沸点较低、热稳定性好的化合物流动相不同极性的液体（有一定亲和作用）惰性气体（无亲和性，只起运载作用）温度一般室温较高检测器紫外吸收检测器（光电二极管阵列检测器），荧光检测器，电化学检测器，蒸发光散射检测器，质谱检测器，示差折光检测器氢火焰离子化检测器（FID），热导检测器（TCD)，氮磷检测器（NPD），火焰光度检测器（FPD），电子捕获检测器（ECD)等类HPLC与与GC的比较的比较Agilent 1100仪器结构图三、三、Agilent-1100 液相色

4、谱仪液相色谱仪高压输液系统：单元、双元、 四元泵 进样系统：手动、自动 分离系统：C18、C8色谱柱检测系统：检测器71、高压输液系统l储液器： 0.5L2L的玻璃瓶（白色、棕色）。l脱气装置： 将气体从溶剂中除去，离线脱气和在线真空脱气。l高压输液泵：恒压泵、恒流泵恒流泵使用最广泛，有单活塞和双活塞往复泵。流量准确、可调，流速为0.52 mL/min，泵最大流量范围为510mL/min（排气泡排气泡）。流动相流动相nHPLC HPLC 级级溶剂n水为超纯水n过滤 (最大0.45 m, 0.2 m最好)n脱气，尤其在低流速时n相溶9液相色谱手动进样器2、进样系统10准备时，流动相直接进柱，进样

5、口1与定量管连接，样品充满定量管后，多余样品从2流出。进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部携带进入色谱柱分析。注射器注射器11气气相色谱注射器的针头为相色谱注射器的针头为尖尖，液液相色谱的注射器针头为相色谱的注射器针头为平平，两者不能混用。两者不能混用。色谱柱是液相色谱的色谱柱是液相色谱的心脏部件心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。，它包括柱管与固定相两部分。柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长0 30 cm，固定相固定相粒径粒径 5 10m 。发展趋势是发展趋势是减小填料粒度减小填料粒度和和柱径柱径以提高柱效。以提高柱效。色谱柱色谱柱3 3、色谱柱色谱柱

6、 反相柱反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有表面键合有极性相对较弱官能团极性相对较弱官能团的键合相。的键合相。样品流出色谱柱的顺序是样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最极性较强的组分最先被冲洗出先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。有更强的保留。常用的反向填料有：常用的反向填料有：C C1818（ODSODS）、）、C C8 8（MOSMOS）、）、C C4 4（ButylButyl）、）、C C6 6H H5 5（PhenylPhenyl）等。）等。 正相柱正相柱-固定相通常为硅胶以及其他固定相通常为硅胶以及其他具

7、有具有极性官能团极性官能团胺基团，如（胺基团，如（NHNH2 2）和氰基）和氰基团（团（CNCN）的键合相填料。）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（由于硅胶表面的硅羟基（SiOHSiOH）或其）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即是依据样品中各组分的极性大小，即极性极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。14 手性色谱柱手性色谱柱-是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相，来实现外消旋物的广泛分离。特点：具有专一性、通用性不广。价格较贵。 紫外吸收检测器（Ultraviole

8、t Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD） 荧光检测器（Fluorescence Detector，FD） 示差折光检测器（Refractive Index Detector，RID）4、液相色谱检测器液相色谱检测器下列优良下列优良/常规实验操作能够延长仪器寿命常规实验操作能够延长仪器寿命：l流动相和样品进行过滤。l保证溶剂的相溶性。l仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。l对仪器进行定期维护和保养。l定期使用甲醇或异丙醇冲洗系统。色谱过程色谱过程：在有互不相溶的两相流动相和固定

9、相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配分配的过程。 由于流动相、固定相以及溶质混合物性质性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为色谱行为，从而使各组分彼此相互分离相互分离。 18四、四、基本分离原理基本分离原理色谱分析法的实质色谱分析法的实质：不同溶质分子因结构不同而与流动相及固定相的相互作用力相互作用力不同，从而引起在色谱柱内运行过程中作用机理的差异。经过柱内多次作用的叠加后在宏观上引起其在柱内停留时间柱内停留时间（保留时间保留时间）的差异，形成事实上的分离。19基本分离原理基本分离原理 分配色谱： 液液分配色谱（Liq

10、uid-liquid partition chromatography） 化学键合相色谱（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相离子对色谱 液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC） 离子交换色谱（Ion-exchange chromatography） 空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography） 亲和色谱法（Affinity chromatography）分配色谱 反相分配色谱：流动相极性固定相极性 正相分配色谱：流动相极性固定相极性反

11、相：固定相：C18, C8 流动相：水，甲醇，乙腈等极性溶剂的混合溶剂 适合极性小的芳香族化合物正相：固定相：-CN, -NH2 流动相：烷烃，异丙醇，四氢呋喃等的混合溶剂 适合于极性差异大的化合物2223液相色谱流动相液相色谱流动相 液相色谱分析中，在紫外区有明显吸收紫外区有明显吸收，可以利用紫外检测器进行检测，其工作原理是Lambert-Beer定律。24五、五、基本检测原理基本检测原理定性定量分析的原理定性定量分析的原理 用标准物比对法定性用标准物比对法定性：特定组分在同色谱条件下有不变的保留值(时间、体积等)，可将之与已知纯物质的相应保留值相应保留值作比对的方法进行定性分析。25三聚氰

12、胺三聚氰酸猪肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析 用外标法定量用外标法定量：以不同量标准样品进样得到峰面积，然后作图得标准曲线，求出回归方程，得到相关系数。然后进样得到被测试样的峰面积从曲线中查到含量。 方法适用于样品复杂，但只对部分组分感兴趣时。 26定性定量分析的原理定性定量分析的原理 校正归一化法定量校正归一化法定量：因不同组分的紫外吸收情况不同，等量样品的吸光度值不相等。因而需要采用校正归一化法定量: 方法适用于样品不很复杂，且部分组分都能流出色谱柱并在检测器上有响应时。 27定性定量分析的原理定性定量分析的原理100%iiiiif APf AisisiW AfW A Agilent-1100

13、液相色谱仪：28四元高压泵 C18色谱柱手动进样器可变波长紫外检测器色谱工作站六、实验内容六、实验内容实验步骤I 打开计算机启动“bootp”文件，然后打开仪器电源建立计算机和仪器的连接。启动工作站（online），调整好流动相流量和检测波长，等待基线平直。29前期准备前期准备实验步骤II 在甲醇:水=80:20、70:30、65:35的不同配比流动相中分别取未知试样25L进样分析，记录保留时间和各组分间的分离度，以分离度大于1.5且保留时间最短为原则选定最佳流动相配比。 注意：每次更换流动相都需等待5min左右以平衡色谱系统。30条件试验条件试验 I流动相配比流动相配比实验步骤III 在最佳

14、流动相配比条件下，以0.8、1.0、1.2 mL/min不同的流动相流速下取混合标准溶液25L进样分析，以同样原则选定最佳流动相流速。 问题I：每次更换流动相还需等待每次更换流动相还需等待5min吗？吗？ 问题问题II：可以利用本步骤实验数据进行定：可以利用本步骤实验数据进行定量校正因子的确认吗？量校正因子的确认吗？31条件试验条件试验 II流动相流速流动相流速实验步骤IV 在最佳实验条件下，分别取纯甲酯、丙酯、丁酯各10L进样，记录各色谱峰保留时间，与步骤步骤III所得结果相比较，进行定性分析。 32定性分析定性分析实验步骤V 在最佳实验条件下，分别取25 L混合标样进样，以峰面积对浓度作标准曲线。 要求该曲线的相关系数大于0.99，如果不满足则可对明显偏离的实验进行重测。33标准曲线制作标准曲线制作实验步骤VI 取25L 未知试样进样分析（重复3次），外标法定量。 结束：用100%甲醇冲