组织裂解液和细胞裂解液的配制

1、组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （

2、钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、 吸出刮好的细胞裂

3、解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70。4方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100µ

4、g/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3µmol/L(1µg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20保存）裂解操作程序：* 离心收集1×107 个细胞* 加入4预冷1%N

5、P-40裂解液100µl* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4放置1530min* 4离心，15 000rpm,10min，取上清备用。 方法三· 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系· 150 mM NaCl 等渗体系· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂· 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂· 5 µg/ml Aprot

6、inin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂· 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂· 1% Triton x-100 破坏细胞·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 · 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系· 150 mM NaCl 等渗体系· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂· 1 mM EDT

7、A 变性剂和稳定剂· 5 µg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂· 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂· 1% Triton x-100 破坏细胞·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂·0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，20保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。 · 用于普通的 Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)

8、，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40 裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)

9、或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或 SDS裂解液。RIPA裂解体系： 150 mmoL/L Nacl， 1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脱氧胆酸钠， 0.1% SDS， 50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。一、组织裂解液配制组织裂解液配方： 7M      Urea(60. 06)    4.2042 g2M  

10、60;   thiourea(76.12)  1.5224  g100mM  DTT           0.1543  g4%      CHAPS        0.4     g0.5mM   EDTA    &#

11、160;    0.00146 g40Mm    Tris          0.0485  g2%(v/v)   NP-40        0.2    ml1%(v/v)   Triton X-100   0.1    ml5mM  P

12、MSF用前加     0.00871 g2%pharmalyte           0.2ml共10ml分装成400µl/每管（可应用于30-80毫克组织裂解）注：已配好分装成400µl/每管可供应用不需另配！细胞裂解液配方：6M      Urea(60. 06)    1.8018  g2M     t

13、hiourea(76.12)  0. 7613  g65mM   DTT          0.050    g4%      CHAPS       0.2      g40Mm    Trisbase    

14、; 0.02425   g共5ml分装成200µl/每管（可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解） 细胞裂解液：      组织裂解液配方：7 mol/L 尿素、          7M      Urea(60. 06)     4.2042 g      

15、60;                                                 

16、60;2 mol/L硫脲、           2M      thiourea(76.12)  1.5224  g2% NP-40、             2%(v/v)   NP-40        0.2

17、0;   ml1% Triton X-100、        1%(v/v)   Triton X-100   0.1    ml65 mmol/L DTT、  0.1003g  100mM  DTT           0.1543  g5 mmol/L PMSF、  

18、0;      5mM  PMSF用前加    0.00871 g4% CHAPS、             4%      CHAPS        0.4     g40 mmol/L Tris、  

19、60;       40Mm    Tris          0.0485  g2% pharmalyte（pH3-10）、2%pharmalyte           0.2ml          

20、0;               0.5mM   EDTA        0.00146  g25 mg/L DNase I、7 mg/L RNase A、20 mg/L aprotinin、20 mg/L leupeptin、2 mmol/L Na3VO4、Phosphatase Inhibitor Cocktail 1Phosphatase Inhibitor Cocktail 21ml水化液配方：8M