生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的

1、十实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定目的要求：1 学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 测定的方法彈性磷酸酶(Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1嗇称为ALPase)广泛諒在于微生物界和动物界。 ALPase能催化元乎所有的磷酸单酯的水解反应, 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：(1) 譲用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温

2、下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸鞍在水中溶解度很大(20°C,每升可溶760克)， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。(3) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才 有效。酶活力的分析：通常是以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物，在pHlO.l的碳酸盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解 下生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm < 的增加计算酶活力的

3、大小。酶活力定义为：在37°C下，以2 mmol/L pNPP为底 物，在pHlO.l的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 pimol/L pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林酚试剂(FolinPhenol reagent)显色法3操作方法3.1牡蛎碱性磷酸酶的分离提取（1）每组称取20 g牡蛎（蒸憾水洗净），加入50mL_L页先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5, 0.1 mol/L NaCl）,（两组一趙）于高速组织捣粹机匀浆1 min,于

4、讯錯4£故置1 h逸彳亍抽捷。（2）室温离心，3000 r/m 20 min,收集离心上清液，（两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待 测酶的比洁力。）（3）在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸钱至0.35饱 和度（lOOmL加入20.9 g） o缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置lh。（4）室温离心，3000 r/m 20 min,收集离心上清液， 并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 mol/L Tris- HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡， 待测罐的比爵力。）(5) 0.35饱和硫酸钱上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 鞍至0.70饱和度(lO

5、OmL加入23.8 g) o缓慢加入, 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。(6) 聿温离心，4000 r/m 20 min,收集沉淀物。(7) 轴到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5-装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SCV-被检测 岀为止(可用一定浓度BaCl?溶液检验)。(8) 取出酶溶液，冷冻高速离心(0°C 25000 r/m 30 min) o(9)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4 °C冰箱保存。20 g牡蛎*上清液加入50

6、 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCI缓冲液（pH 7.5, 含0.1 mol/L NaCI）,于高速组织捣粹机匀浆1 min,于冰箱 4°C放置1 h进行抽提。室温离心，4000 r/m 20 min,收集离心上清液，并量体积。缓慢加入研磨细粉的固体硫酸鞍至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g）,不断搅拌溶解，置冰箱静置lh。室温离心，4000 r/m 20 min,收集离心上清液，并量体积。0.35饱和硫酸鞍上清液加入固体研磨细粉的硫酸鞍至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g） o 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。室温离心，4000 r/

7、m 20 min,收集沉淀物。沉淀溶于5mL含0.1 mol/L NaCI 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5 o 装入透 析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SCV-被 检测出为止粗酶液3.2比活力测定321对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，1 7号各二支，按下列表格操作。管号01234567pN#含量(ymol)00.050.100.150.200.250.300.350.5jLimol/mL pNP (mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O (mL)0.80.70.60.50.4

8、0.30.20.1Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL20 mmol/L MgCl? (mL)各管加入0.2 mL0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mLOD 405 nmDoooo以对硝基苯酚的绝对量（呵0|数）为横坐标，OD405nm值为纵坐标, 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数（£）值。£=8.80 x 103（ mol/L）'1 - cm-13.2.2酶活力的测定管号空白1235 mM pNPP(mL)各02mLNa2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL20 mmol/L MgCl9 (mL)各管加

9、入0.2 mLH.O (mL)J各 0.50mL混匀，37°C, 5分钟酶液（mL）各O.lmL37°C,精确反应10分钟0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mL酶液（mL）O.lmL°D 405 nm1以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产 物的pimol数，算出酶活力。加酶1间(mil1 寸1)0.5mlm加NaOH时间10.511反应时 间(min)1010管号122131.5m2m2.5m11.51212.51010103 14415513m3.5m4m4.5m5m1313.51414.5151010101010

10、323蛋白浓度的测定本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。卜上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用TrisHCI缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释510倍）。3.3结果处理计算：酶活力（U/mL）蛋白浓度式中：A为稀秣倍数， juimol数，t为反应时间，C(mg/mL) =AV2H为由标准曲线查得的pNPC为由标准曲线查得的蛋白mg数，V为测定酶活力所用的酶量（mL数）V?为测定 酶活力所用的酶量（inL数）酶的比活力（U/mg）=酶活力（U/mL）蛋白浓度（mg/mL） 纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率二各步总活力*100/第一步总活力将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）步骤总体 积mL蛋白 mg/ mL总蛋 白mg酶活 力U/m总活 力U比活 力U/m纯化倍“得率%匀浆过滤液4007.242上3g正丁醇处理上清液47033.80.35饱和(NH4)9SO4 h 清液44035.30.7饱和（nhJ2so4沉淀 溶解透析上清液40.3314.7DEAE-32 酶液9.63.821002.2Sephadex G75 酶液13.20.49451.5Sephadex G