放烧复合伤小鼠小肠粘膜免疫变化与肠源性感染关系的研究

1、放烧复合伤小鼠小肠粘膜免疫变化与肠源性感染关 系的研究放烧复合伤小鼠小肠粘膜免疫变化与肠源性感染关系的研究中华放射医学与防护杂志1999年第1期艾国平粟永萍刘晓宏王东海王军平程天民冉新泽摘要 目的：探讨放射损伤、烧伤与放烧复合伤后小鼠小肠粘膜免疫变化 及其用细胞因子调控后与肠源性感染的关系。方法：采用斑点杂交、免疫组化、免疫酶联吸附实验、细菌培养等方法。结果：三类伤组伤后均出现小肠粘液sIgA含量显著降低，浆细胞数量减少，肠道细菌移居增多，肠系膜淋巴结 IL-4mRNAfe达降低，尤以复合伤组最重。用IL-4蛋白调控后，三类伤组肠 道浆细胞的数量增多，小肠粘液中 sIgA含量相应增加，肠道细菌

2、移居减少。结论：伤后粘液中sIgA的降低与肠源性感染的发生密切相关，其原因与分泌 sIgA的淋巴细胞数量减少和功能障碍有关；而促进粘膜免疫功能恢复，对减低 肠源性感染发生较为有利。关键词：放烧复合伤小肠粘膜免疫肠源性感染大量研究证实口2、烧伤后肠上皮机械屏障和粘膜免疫屏障的损害是肠源 性感染发生的主要因素。肠上皮细胞和肠道淋巴细胞对辐射高度敏感，在放烧 复合伤这样一个特定的损伤条件下，肠源性感染可能更为突出，而小肠粘膜免 疫变化有什么特点？与肠源性感染的关系如何？怎样防治？本实验为此进行了研 究。材料和方法1 .实验动物：昆明种 健康雄性小鼠110只，体重2025g,由本校实验动 物中心提供。

3、2 .致伤和分组：照射源为6°CoT射线，全身一次均匀照射8gy,吸收剂量 率为56.358.2 cGy/min;烧伤采用3%8周汽油燃烧背部致15%勺出度烧伤(病 理切片证实)；复合伤则于30分钟内先烧后照射。实验设正常、放射、烧伤、 复合伤等4个对照组和放射防治、烧伤防治、复合伤防治等3个治疗组。每组设6和72小时2个时相点。治疗组6小时取材者于伤前2、1和当天各腹股沟 皮下注射1次白细胞介素4(IL-4)0.05 ml(6 000U);72小时取材者伤后连续给药3天。正常对照组注射等量生理盐水。每组 6只动物。3 .检测指标：小鼠肝、脾、肠系膜淋巴结细菌培养：用LB和麦康凯培养

4、基，37c孵育24小时，计数菌落数量。小鼠小肠粘液 sIgA测定：用免疫酶 联吸附实验检测。卷肠切片，IgA免疫组化观测：按SP试剂盒说明改进后进 行，光镜观察，计数10根绒毛浆细胞数，换算出每根绒毛的浆细胞数。肠系 膜淋巴结IL-4的斑点杂交：用地高辛标记的约 500 bp IL-4 探针与肠系膜淋巴 结提取的RNA1点杂交，结果进行薄层扫描分析。4 .统计学处理：用哈佛统计软件，进行双因素方差分析及均数间的显著性 差异检验。结果1 .伤后小鼠肝、脾、肠系膜淋巴结细菌培养结果伤后6小时细菌移居的严重程度依次为：复合伤组放射损伤组烧伤 组，两伤复合后大于单一伤但小于两单伤之和；以肠系膜淋巴结细

5、菌移居数量 最多，脾脏次之，肝脏最少；用IL-4防治和治疗后细菌的移居率较致伤组明显 减少。2 .小肠粘液sIgA的变化伤后6小时，小肠粘液中sIgA的吸光度（A值）均降低，与正常对照相比， 差异有非常显著性（P<0.01）；而用IL-4防治后sIgA的A值则明显升高；但72 小时与6小时组问差异无显著性（见表1）。表1小鼠小肠粘液中sIgA的A值（x ±s）sIgA的A值组别6小时72小时正常0.47 ±0.050.46 ±0.03*0.23 ±0.03*0.27 ±0.02烧伤烧+治0.40 ±0.05 "0.47

6、 ±0.03 "放射*0.25 ±0.02*0.28 ±0.0 2放+治0.43 ±0.04 "0.49 ±0.05 "复合伤0.28 ±0.03*0.26 ±0.05复+治, 0.49 ±0.030.49 ±0.04 "p<0.01;与正常组比较*P<0.013.小鼠注：n=6; 与相应伤情组比较 小肠IgA免疫组化观测用IgA单抗可特异显示，分泌IgA的浆细胞与IgA起反应的浆细胞主要分 布于小肠固有层和淋巴滤泡中，伤后 6和72小时，浆细胞数量明显

7、减少（P< 0.01）,以复合伤组减少程度最为明显；伤后 72小时较6小时稍有增多，但差异 无显著性；而用IL-4防治和治疗后浆细胞数量明显增多（P<0.05，见表2）。表2小鼠小肠固有层浆细胞的数量（个/每根绒毛）浆细胞数量组别6小时72小时正常17.6 ±1.616.9 ±2.1烧伤*8.2 ±0.8*9.0 ±0.7烧+治13.4 ±1.1 *515.8 ±1.3*"放射*7.6 ±0.8*9.2 ±0.8放+治* 13.2 ±0.816.0 ±1.2*"复

8、合伤6.0 ±0.7*7.8 ±1.0复+治*12.4 ±1.013.6 ±1.1 *"注：n=6; 与相应伤情组比较P<0.01 ;与正常组比较*P< 0.05, *P<0.014.伤后肠系膜淋巴结IL-4基因表达的变化伤后6和72小时组与正常对照比较，肠系膜淋巴结 IL-4mRNA表达均降低 (P< 0.01) , 72小时较6小时表达增强(P< 0.05),但仍低于正常对照组(P< 0.01,见表 3)。表3小鼠肠系膜淋巴结IL-4mRNA的变化(mv/ms)IL-4mRNA组别72小时6小时正常29.

9、4 ±1.828.6 ±1.218.6 ±1.18.9 ±0.612.2 ±0.6烧伤10.6 ±0.8放射14.8 ±0.6复合伤注：n=6;与正常组比较*P< 0.01;与6小时组比较不< 0.05讨论1 .肠粘膜免疫屏障损害与肠源性感染的关系肠道是一个有菌的环境。生理状况下，肠道菌群微生态之间、肠粘液层、肠上皮细胞及细胞间的紧密连接、上皮下基底膜及肠淋巴组织等共同构成肠道特有的抗感染屏障，而不发生肠源性感染。烧伤早期，肠壁组织血液循环障碍明显，肠绒毛细胞灶性变性坏死，肠固有层中浆细胞数量减少，肠粘液中 sI

10、gA含量降低，引发肠源性感染。肠上皮细胞及肠道淋巴组织均具有高度辐射敏感性，与单纯烧伤比较， 8gy 放射损伤和复合伤肠上皮细胞损伤更为严重，绒毛上皮坏死脱落后造成上皮屏障“缺口”，细菌易于入侵；加之射线对淋巴细胞的直接抑制，肠道淋巴细胞数量减少，相应合成分泌IgA 的浆细胞数量明显减少， sIgA 含量降低，肠源性感染加重。2 . 粘膜免疫障碍机理及调控本实验证实，放射损伤、烧伤及放烧复合伤后肠粘液中 sIgA 呈不同程度降低，经调控提高IgA 分泌量后，肠源性感染的发生率降低，程度减轻，表明肠道粘膜免疫中的sIgA 水平与肠源性感染的发生密切相关。体外细菌粘附实验3 表明正常小肠粘液有抗大

11、肠杆菌粘附培养的IEC-6( 正常大鼠空肠上皮细胞株)的作用，而烧伤动物肠粘液的这种作用明显减弱；又将IgA 单抗与正常粘液中和，其作用显著减弱，说明小肠粘液中 IgA 有抗细菌粘附肠上皮细胞的作用。不少研究证实4， 5 IgA 在抗肿瘤及某些肠道疾病的发生发展中起重要作用。因此，如何调控IgA 具有重要理论意义和实用价值。IgA由浆细胞合成分泌，浆细胞由 B淋巴细胞分化而来，B淋巴细胞增殖分 化受TGF-B、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等细胞因子调控。其中IL- 4又称B细胞生长因子-1(BCGF-1)，是目前报道的唯一能促进静止 B淋巴细 胞增殖的细胞因子，同时还能促

12、进特异的重链稳定区 (CH)Ig 类型的转换，使IgM型B细胞转换成IgA型B细胞9、这些体外研究结果表明IL-4在调控B 细胞增殖、转化中有重要作用。我们研究观察到三种损伤后肠系膜淋巴组织中IL-4mRNA的表达有不同程度降低，以复合伤最明显；相应地，复合伤组的浆细胞数量减少最显著，小肠粘液中IgA下降程度最明显，肠源性感染最严重。对机体补充IL-4 ,上述损害明显减轻。因此，我们强调对损伤后调控IL-4等基因表达或者补充IL-4等蛋白对调控B细胞增殖分化，增强浆细胞合成分泌IgA, 对防治肠源性感染有实际意义。本课题受国家自然科学基金资助（项目号：39670289）作者单位：400038重

13、庆，第三军医大学预防医学系全军复合伤研究所 （艾 国平、粟永萍、刘晓宏、王军平、程天民、冉新泽 ）；解放军第二六四医院烧伤 科（王东海）参考文献1马利，黎鳌，肖光夏，等.肠源性感染的实验研究.第三军医大学学报, 1990,12（1）:1-69.2Cappler WA.Reduction in biliary IgA after burn injury. Am Surg, 1992,25(4):338-340.3白晓东，粟永萍，刘贤华.严重烧伤后肠粘液成分变化与肠源性感染的 关系.中华整形烧伤外科杂志、1996, 12: 90-92.4蔡文琴，王伯瀛.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四

14、川科 学技术出版社，1994.258-266.5Brandtzaeg P.The role of humoral mucosal immunity in the induction and maintenance of chronic airway infections. Am J Respir Cirt Care Med, 1995,151:2081-2087.6Herman F,Garret N,Thomas J.Mucosal immunity to HIV-1 systemic and vaginal antibody responses after intranasal immunization with the HIV-1 C4/V3 peptide T1 sP10MN(A).J Immunol, 1996,157:462-472.7Howard M.Identification of a T cell derived B cellgrowth factor distinct from interleukin-2.J Exp Med, 1982,1