实验四逆转录PCRRTPCRWord版

1、传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！实验四 逆转录pcr (rt-pcr)【实验目的】1了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。2学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应（pcr）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板dna扩增达106 倍。rt-pcr将以rna为模板的cdna（complement dna）合成（即rna的反转录（rt，reversetranscription），同

2、cdna的pcr结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cdna克隆的快速灵敏的方法。由于cdna包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此rt-pcr成为目前获得目的基因的一种重要手段。 rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。 rt-pcr的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从rna合成 cdna，即总r

3、na中的mrna在体外被反向转录合成dna拷贝，因拷贝dna的核苷酸序列完全互补于模板mrna，称之为互补dna（cdna）；然后再利用dna聚合酶，以cdna第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dntp）为材料，在引物的引导下复制出大量的cdna或目的片段。 在rt时，有3种引物可选择 （表4.1) 。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cdna，还要用此产物做pcr的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等软件设计引物。rt-pcr可以一步法或两步法的形式进行。两步法rt-pcr比较常见，在使用一个样品检测或克隆

4、多个基因的mrna时比较有用。在两步法rt-pcr中，每一步都在最佳条件下进行。cdna的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行pcr。而一步法rt-pcr具有其它优点（表4.2），cdna合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总rna，因为整个cdna样品都被扩增。对于成功的一步法rt-pcr，一般使用基因特异性引物(gsp)起始cdna的合成。由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。这种方法经常用于获取5末端序列及从

5、带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一般选用poly(a)+rna。 oligo(dt)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mrna 3端所发现的poly(a)尾杂交。因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2，所以与使用随机引物相比，cdna的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及poly(

6、a)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dt)。oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr。 基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。gsp是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。gsp可以同与mrna 3最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ 已经制备好的双链cdna和一般dna一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当

7、的接头(linker)，接头可以是在pcr引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经pcr扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna的末端接上一段寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。 本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因，fas配体(fasl)是一分子量约为40u的ii型跨膜糖蛋白，属tnf家族成员。活化的t细胞可表达fas和fasl，并通过fas/fasl系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中fasl表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并构建

8、其表达载体，可以为进一步研究fasl的功能提供条件。在上下游引物的5端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基（即hind iii和bamh i），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pgfpuv上（附录图4.3）。 为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pgfpuv，在其上加了6his标签。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！【试剂与器材】（一）试剂1.总rna（或mrna）2.rna酶抑制蛋白（rnase inhibitor） ：40 u/ml3.dntp 混合物 (各10 mm)4.oligo(dt)12-18：2.5 mmol

9、/l5.10*逆转录合成缓冲液（10rt buffer）：250 mmol/l tris-hcl (ph8.3)，375 mmol/l kcl，15 mmol/l mgcl26.amv逆转录酶 5u/ml7.基因特异性5和3引物各20 mmol/l 8.tap dna聚合酶 5u/ml9.10*pcr缓冲液：500mmol/l kcl，100mmol/l triscl，在25下，ph9.0，1.0% triton x-100，15mmol/l mgcl2。（二）器材1）pcr仪，2）pcr管，3）微量移液器【操作方法】（一）逆转录：1)建立rt反应体系：传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助

10、，可双击去除！2)涡旋混匀，42反应1小时，95加热5分钟，然后置于冰上。（二）pcr扩增：1)建立pcr反应体系：2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环： step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。（三）取10-20ul pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的pcr产物-20保存。【注意事项与提示】1.逆转录反应过程，需建立无rnaase环境，以避免rna的降解。2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如edta或sds。此外，rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中沾染的基因组dna。使用

11、较好的rna分离方法，如trizol reagent，会减少rna制备物中沾染的基因组dna。因此在进行pcr反应时应该对每个rna模板进行一个无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组dna还是cdna。在无逆转录时所得到的pcr产物来源于基因组。3.rt-pcr的起始模板可是总rna或mrna，都可以检测到扩增结果（如下图）。另外，分离mrna会导致样品间mrna丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有基因时，使用mrna会增加检测的灵敏度。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！4.在逆转录反应中经常加入rna酶抑制蛋白以增加cdna合成的

12、长度和产量。rna酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如dtt）存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。rna酶抑制蛋白仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上rnase对样品的污染。5.较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些

13、困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶， 如：invitrogen 公司的thermoscript逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加rt-pcr的特异性。6.建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板dna和taq dna聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上pcr仪前加矿物油封盖或设热盖。7.pcr反应的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的计算，一般是在引物的tm值上下浮动，tm =2（a+t）+4（g+c）。适当提高复性温度可提高pcr扩增的特异性。8.不管是反转录反应还是pcr反应

14、都应先调制试剂的master mix (包括rnase free dh2o、缓冲液、dntp mixture等)，然后分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂的损失，避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。而且分装试剂时务必用新tip，以防止样品间的污染。 9.amv、rnase inhibitor、taq等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从-20取出，使用后立即放回-20保存。 10.最佳的pcr条件，因pcr扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先做control反应，以确定最佳的pcr条件。为延长pcr仪的使用寿命，应尽可能缩短pcr仪4保存的时间，尽量避免4过夜的情况。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！lane 1：总rna 的 rt-pcr 产物（人细胞调亡因子tf15基因） lane 2： mrna 的 rt-pcr 产物，人细胞调亡因子tf15基因 lan