蛋白质组学研究介绍结合双向电泳

1、 蛋白质组学介绍蛋白质组学介绍 结合结合bio-rad相关仪器相关仪器one genome many proteomes对生物的生化功能,形成途径与代谢过程之研究而更加了解 normal geneexpression基因体功能的最终目的就是表现蛋白质;基因表现及调控(gene expression and regulation)的过程,则是为了保障蛋白质能适时,适地并适量的表现 中心法则中心法则 蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)，就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领

2、域。蛋白质组学与基因组学的关系：蛋白质组学与基因组学的关系：1、蛋白质组与基因组相对应2、基因组是相对稳定的，而蛋白质组是一个动态的概念3、蛋白质组是基因组研究不可缺少的后续部分蛋白质组学蛋白质组学 蛋白质组学的研究可以帮助我们去寻找新的疾病指标,相信在不久的将来将有助于监测疾病的进程,更进一步有助于疾病的治疗。1-1 心血管疾病研究领域心血管疾病研究领域 扩大性心肌病变(dilated cardiomyopathy, dcm )是一种严重的心脏疾病,也是现代繁忙的都市人经常易患的疾病,最后将导致心脏失去功能;病人通常都只能期待换心以维持生命。 运用蛋白质体的方法已经鉴定出心肌中150种蛋白质

3、,比较后发现有25个蛋白质有明显的差异;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人(或高危险群)的蛋白质做比对,或许可以在疾病产生初期达到早期预防的目的. 一、疾病诊断一、疾病诊断蛋白质组学应用蛋白质组学应用1-2肿瘤研究领域肿瘤研究领域1-2-1肺癌肺癌 肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一.临床上肺癌的诊断往往已属晚期.直至目前为止,并无有效的治疗方案可得.所以任何有助于肺癌诊断或预后的发展都是有助于肺癌的治疗方针的。 因此,许多科学家致力于以双向电泳技术研究肺癌.在分析组织病理学上不同种类的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞体会有不同的蛋白质表现图谱。 另外,已发现有一

4、种专一性的蛋白质仅会出现在原发性肺腺癌上.例用此技术将可有效地鉴定出新的肿瘤标志 (tumor marker),在鉴别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益。蛋白质组学应用蛋白质组学应用 人类的肾脏癌是很难治愈的癌症,其中源自于近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌大约占成人恶性肿瘤的3 %.但如同许多实质性肿瘤般,肾细胞癌发现时期均属癌症末期,外科手术已难治愈的阶段.并且无适当的肿瘤标志可参考。 科学家在用双向电泳技术研究肾脏癌组织的研究中发现有四种蛋白质的表现在肾癌细胞中会消失. 虽然该研究没有发现特定的标志蛋白质，但尚有许多可能与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鉴定.1-2-2肾脏癌肾脏癌 蛋白质

5、组学应用蛋白质组学应用蛋白质组学应用蛋白质组学应用1-2-3结肠癌结肠癌 结肠癌是一种常见的癌症.利用双向电泳与免疫转印技术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分离出的一系列蛋白质.并将有意义之蛋白质点切割出,进行蛋白质序列分析以鉴定这些蛋白质。 结果发现 hsp 70 酸性的 isoforms 在结肠息肉 (polypous) 与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论是在量上或质上均有相当的差异;此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或 crohns 肠炎组织中则有不同的 hsp 70 碱性 isoform 被发现。蛋白质组学应用蛋白质组学应用1-3神经精神系统疾病研究领域神经精

6、神系统疾病研究领域 对精神分裂症患者以及正常人群的脑脊液进行蛋白质组学的研究。对老年痴呆症(lzhermer 症)的研究：通过对神经原缠结的2de及质谱分析则发现,其主要蛋白质成份-微管相关蛋白(map)在疾病状态下发生了磷酸化、糖基化等多种修饰作用。二、病原微生物的蛋白质组学研究二、病原微生物的蛋白质组学研究1、确定致病菌毒力;2、寻找新的诊断标记物;3、为疫苗的研制寻找新的候选抗原;4、阐明药物抗菌作用机制与病菌耐药性发生机理,为新的抗生素的研制寻找靶点。蛋白质组学应用蛋白质组学应用三、蛋白质组学在药物开发中的应用 疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点,另外通过翻译后修饰的蛋

7、白质组学研究,使得新药研制获得了前所未有的契机。以dsps为靶点,分析其分子结构,定向合成有效药物成为药物设计的理想模式。蛋白质组学应用蛋白质组学应用蛋白质组学研究流程蛋白质组学研究流程condition acondition b34710ph+-+sample preparationfirst dimensionseconddimensionstainingimaginganalysis &extractionmass spectrometricidentification of spots2-d expression proteomics methodology 根据实验流程介绍相关仪器根

8、据实验流程介绍相关仪器 样品提取试剂盒样品提取试剂盒 通过多维层析的技术可以获得常规2d技术中比较难得到的低丰度低丰度蛋白和疏水性强的蛋白蛋白和疏水性强的蛋白,是对2d技术的一个必要补充。 液相等电聚焦仪液相等电聚焦仪根据蛋白质等电点的不同将其分离，这项功能强大的非变性技术可快速、简单而有效地从复杂蛋白混合物中纯化分离出低丰度蛋白质从复杂蛋白混合物中纯化分离出低丰度蛋白质，快捷的收集已分步分离的样品，合并或富集合并或富集，甚至可以对初步分离的样品进行再分离。对于那些难溶、不溶性蛋白或者不能通过以等电聚焦原理为基础的胶分离手段的样品，使用液相等电聚焦是非常有效的实验方法。根据实验流程介绍相关仪器

9、根据实验流程介绍相关仪器二、样品定量二、样品定量rc dc protein assay 蛋白定量试剂盒蛋白定量试剂盒smartspecplus核酸蛋白测定仪核酸蛋白测定仪根据实验流程介绍相关仪器根据实验流程介绍相关仪器三、双向电泳第一向三、双向电泳第一向protean i12ief等电聚焦仪等电聚焦仪主要特点主要特点每个泳道可独立控制每个泳道可独立控制 这意味着：这意味着：不同的样品不同的样品不同的方法不同的方法不同的不同的ph梯度梯度 bio-rad 是是唯一唯一可以提供独立泳道控制的可以提供独立泳道控制的ief系统系统价值所在价值所在每个泳道独立控制每个泳道独立控制优点：节省时间优点：节省

10、时间减少优化试验条件需要的运行次数减少优化试验条件需要的运行次数同时可运行多个试验同时可运行多个试验优点：保证试验质量优点：保证试验质量个别不良样品不会使整个试验失败个别不良样品不会使整个试验失败更好的重复性更好的重复性原因原因?可对每个泳道设定最大电流可对每个泳道设定最大电流传统的传统的ief是对所有泳道设定一个总的最大电流是对所有泳道设定一个总的最大电流如果同一次运行过程中样品的导电性能差别较大，如果同一次运行过程中样品的导电性能差别较大，可造成电流在各个泳道内分布不均可造成电流在各个泳道内分布不均protean i12 ief : 为每一泳道设定独立的电流限为每一泳道设定独立的电流限制，

11、避免了样品间的相互影响，提高试验重现性和制，避免了样品间的相互影响，提高试验重现性和一致性。一致性。节省时间保证试验质量protean i12 ief cell传统传统ief：每个泳道的电流都受到其他泳道内样品影响：每个泳道的电流都受到其他泳道内样品影响都都受到其他泳道内样品影响受到其他泳道内样品影响60a140a100a100a传统 iefprotean i12 ief等电聚焦原理等电聚焦原理: 在第一向分离中蛋白质先按其等电点不同分开（isoelectric point pi值）。pi值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定ph值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦。

12、 +ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 101-d electrophoresisthe 1st d: isoelectric focusingreadyprep ipg strips根据实验流程介绍相关仪器根据实验流程介绍相关仪器四、双向电泳第二向四、双向电泳第二向sds-pagesds-page+ph 3ph 7.5ph10ph 3ph 7.5ph10chargesizethe 2nd d: sds-pageproteins migrate through the gel at a rate propor

13、tional to their size.smallest proteins travel the furthest distancepim.wt.2-d electrophoresis根据实验流程介绍相关仪器根据实验流程介绍相关仪器五、染色五、染色gs-800densitometerpdquestimage analysis六、图像的采集及分析六、图像的采集及分析pdquest分分析流程：析流程：pdquestintuitive spot detection wizardexcision / digestion七、切胶七、切胶质谱前处理质谱前处理差异蛋白点的切取脱色胶内酶解肽片断提取点样质谱分析数据库比对进行鉴定手工切胶的缺点：手工切胶的缺点： 低丰度蛋白无法准确切取非密闭系统,污染无法避免角蛋白污染其它杂质污染工作时间长全自动蛋白切取仪可切取的范围广泛，速度快，精度高，避免污染。mass spectrometry5000750010000125001500002550751000255075100025507510002550751000255075100025507510050007500100001250