综设实验以α-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段

1、北京师范大学化学学院化学综合实验实验报告课程名称： 以 -胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮 -脑啡肽三肽片段实验时间：_2015.9.232015.10.28_实验地点：基础化学实验中心化学综合实验室学生姓名：学号：2013级 2班_张钰_201311151046_指导老师：_ 邢国文 _ _以 -胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成 N-保护的亮 -脑啡肽三肽片段张钰北京师范大学化学学院摘要： 推荐一个面向理科高年级本科的化学生物学综合实验。以二氯甲烷为溶剂，使用 - 胰凝乳蛋白酶为催化剂合成 N-保护的亮 - 脑啡肽三肽片段。关键词： 综合实验 化学生物学 酶促合成 亮 -

2、 脑啡肽 - 胰凝乳蛋白酶一、实验目的1、 在做实验的同时开阔视野，了解一些近年来学科交叉研究领域的研究热点；2、 熟悉一些化学生物学实验的基本实验方法与技巧，为今后的进一步科研深造奠定坚实的实验基础；3、通过本课程的训练，有效的提高独立科研能力和科研创新能力；4、通过四步反应（独立完成三步）合成N- 保护的亮 - 脑啡肽三肽片段；二、实验原理本实验以酪氨酸（ Tyr ）、双甘肽（ Gly-Gly ）为起始原料，经过四步反应得到了 N-保护的亮 - 脑啡肽前三肽 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 。1、酪氨酸在氯化亚砜的作用下酯化，得到酪氨酸乙酯盐酸盐（HCl Tyr-OEt ）；2、酪氨酸

3、乙酯与苄氧羰酰氯（Z-Cl ）在碱性条件下反应，得到苄氧羰酰酪氨酸乙酯（ Z-Tyr-OEt ）；3、Gly-Gly 在氯化亚砜作用下酯化，得到甘胺酰甘氨酸乙酯盐酸盐（ HClGly-GLy-OEt ）；4、Z-Tyr-OEt 与 Gly-GLy-OEt 在二氯甲烷中以 - 胰乳蛋白酶催化得到亮 - 脑啡肽的前三肽，即 N-保护的苄氧羰酰酪氨酰甘 胺酰甘氨酸乙酯（ Z-Tyr-Gly-GLy-OEt ）。三、实验药品分子mp/bp/ 溶解性药品名形状nDd量CC乙乙水醇醚乙醇无色液体461.3610.79-117.78.5易易易43溶溶溶氯化亚砜淡黄色发烟118.91.64-10578.8分易

4、易液体6解溶溶白色叶状结132.1Gly-Gly晶或片状晶262溶难不2体，有光泽Tyr白色结晶粉181.21.456342难不不末0乙醚无色透明液74.121.350.7134-116.34.6微溶溶体3HCl-Tyr-OEt白色结晶245.7溶溶溶HClGly-GLy-O白色结晶196.6溶溶溶Et乙酸乙酯无色液体88.111.3710.902-83.677.2溶溶溶9碳酸氢钾白色晶体100.1溶不不2苯甲醇无色液体108.11.5391.0419-15.3205.7溶易易36无色有刺激分苄氧羰酰氯性气味的液170.5溶溶解体硫酸镁白色粉末1202.66112.4溶微不石油醚无色透明液0.

5、64 40不溶溶体0.6680Z-Tyr-OEt白色晶体343Z-Tyr-Gly-Gly-白色晶体449.1OEt无色油状液101.11.401-114.三乙胺体，有强烈0.72689.5微溶溶908氨臭丙酮无色液体58.080.7841.3588-94.756.05溶溶溶5四、实验步骤（1）、HClGly-Gly-OEt的合成、取 8Ml 无水乙醇，用冰盐浴冷至-10 ，缓慢加入 2Ml 氯化亚砜，加完后继续搅拌 20min。、加入 Gly-Gly1.0g ，先初步摇匀，放入磁子，用磁力搅拌器室温搅拌3 天。、用旋转蒸发仪减压除去溶剂得到白色固体。、用乙醇 - 乙醚重结晶：先用 3mL乙醇微

6、热，将固体溶解；在逐步加入乙醚，刚开始一段时间没有晶体析出，用玻璃棒摩擦瓶壁，很快析出大量白色结晶。、抽滤。烘干并称重，记录质量 m1=1.16g。（ 2）、Z-Tyr-OEt 的合成：、将 HClTyr-OEt 0.8g 悬浮于 16mL乙酸乙酯中，加入 KHCO32g 的 13mL水溶液，冰浴下快速搅拌， 15min 内滴加 Z-Cl 的苯甲醇溶液 0.7Ml 。、加完后搅拌 20min，撤去冰浴，室温再搅拌 2-3h 。、反应结束后用4mol/L 的盐酸酸化，使水相的pH为 1，分出有机相，用水、饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥。、减压蒸除溶剂后，得到黄色油状物，置于冰水中，缓慢结晶，过滤得第

7、一批晶体；在母液中加入缓慢加入石油醚再结晶得第二批晶体，共得产物称重，记录质量m2=0.64g。（ 3）、以 - 胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 。、取 0.425gZ-Tyr-OEt与 HClGly-GLy-OEt0.25g 悬浮于 12.5mL 二氯甲烷中，加入三乙胺 350uL 并在搅拌使底物完全溶解；、调节 pH 值约为 10，反应液为均一透明溶液；、加入 - 胰凝乳蛋白酶 5mg和用注射器加入 50uL 水。室温下搅拌反应1-2天，反应液中有白色沉淀产生。、反应 3 天后，测反应后体系的pH，将反应液过滤，滤饼依次用二氯甲烷、1mol/L 盐酸、去离子水洗涤。在

8、红外灯下烘干产物，称重记录质量m3=0.2g。五、实验数据记录和处理（ 1） HClGly-Gly-OEt 的产率：m1=1.16gM理论 = 1.2gw=m1/ M理论 100%=96.7%;（ 2） Z-Tyr-OEt 的产率：m2=0.64gM理论 =0.8gw=m/ M理论 100%=80%,产物颜色偏黄，可能有副产物生成，或者是洗涤不够充分，所以测量产率偏高（ 3） Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 的产率：m3=0.2gM理论 =0.625gw=m/ M理论 100%=32%产率低，并且产物不能溶于丙酮。 可能所得产物不是目标产物，而是副产物或者是反应物。原因分析：、反应物为上一

9、次实验所得的产物，可能含有杂质，影响到此次的实验；、操作过程中，水的滴加速度过快，且没有控制好用量，加得过多，而水的含量过多会使酶的活性降低；六、实验思考与讨论1、 冰盐浴：冰盐浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当食盐和冰均匀地混合在一起时，冰因吸收环境热量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低，而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低） 。这将导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融化过程中因大量吸热而使体系温度降低。一般能降到 -20 。2、氯化亚砜：遇水遇热易分解

10、：SOCl2+2HO=H20+SO2+2HCl在 HCl Gly-GLy-OEt 、 HCl Tyr-OEt 合成中的作用：A. 作为氯化剂；B. 使成酯反应更易进行，与一般酯化不同的是，在氯化亚砜的作用下，酯基中的两个氧原子都来自于羧基。3、 双溶剂重结晶的适用条件及操作混合溶剂重结晶：原理：某种有机物在某溶剂中溶解度很好时，先用最少量的该溶剂加热溶解，再加入溶解度稍差的另一种溶剂，降低该有机物的溶解度，然后降温析出晶体。混合溶剂重结晶步骤：、按照选择溶剂的方法，试出混合溶剂各自量的比例、将被重结晶物质加热溶解于适量的易溶溶剂中、趁热过滤，以除去不溶性杂质、用滴管逐滴加入热的不易溶的溶剂，直

11、至出现浑浊，且不再消失为止、再加热使其澄清，若不澄清，可再加较少量的易溶溶剂，使其刚好澄清、将此热溶液在室温下放置，冷却析出晶体本实验中C2、 C3、 C5 提纯均用到双溶剂法（又称反溶剂法）重结晶，即先将待提纯物质溶于少量良溶剂（产品在溶剂中溶解性很好） ，可适当加热，并及时滤去不溶性杂质，确保溶液澄清透明。然后将大量不良溶剂（产品溶解性较差）注入到溶液中等待结晶。注意事项：若局部结晶过快导致晶型不佳，可沿瓶壁缓慢滴入，且勿震荡过猛；：若晶体不敏感，则注入适量不良溶剂再震荡即可，也可以加晶种诱导结晶。：注意良溶剂与不良溶剂需互溶。4、影响有机溶剂中酶促反应的因素：酶在各种有机溶剂体系中表现出来的催化性质( 包括酶的活性、稳定性及专一性) 相差甚远 , 主要取决于反应体系中水的含量和所选用的溶剂。（1）、溶剂的影响： 溶剂对酶的影响体现在其对酶的蛋白质结构、分子柔性以及活性中心的作用。 - 胰凝乳蛋白