HBsAg免疫对小鼠 TB细胞功能的影响PPT课件

1、实验流程1W1.双向免疫扩散试验 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) OVA+CFA加强免疫小鼠500 l 摘眼球取血无菌取脾和胸腺分离血清2W取脾和胸腺淋巴细胞转化试验 生理盐水加强免疫小鼠500 l 2WAfter 1W对照组实验组抗体效价增殖功能第1页/共13页实验内容小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验第2页/共13页教学要求 掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作第3页/共13页淋巴细胞转化试验(Lymphocyte transformation test)原理原理检测方法检测方法操作步骤操作步骤应用应用第4页/共13页实验分组及材料器材器材l酒精棉球酒精棉

2、球若干若干l无菌纱布块无菌纱布块 1块块/组组l无菌平皿无菌平皿1块块/组组l无 菌 吸 头 （ 大 、 中 、 小 ）无 菌 吸 头 （ 大 、 中 、 小 ） 4 盒盒/rooml无菌无菌96孔培养板孔培养板1块块/组组l可调微量加样器可调微量加样器4套套/rooml细胞计数板细胞计数板1套套/组组l显微镜显微镜1台台/组组lEP管管若干若干l眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子4套套/room1.细胞培养箱（细胞培养箱（37 5%CO2)l酶标仪酶标仪l离心机离心机2个个/rooml超净台超净台2个个/roomv动物及试剂动物及试剂$ 小鼠小鼠 2只只/组组(NS,OVA)1 培养液（培养液（I

3、MDM) 无无FCS 100ml/room1 培 养 液 （培 养 液 （ I M D M ) 2 0 % F C S 30ml/room$ ConA（2.5,5,10g/ml) ml/tube $ 白 细 胞 计 数 液 （白 细 胞 计 数 液 （ 2 % 冰 醋 酸 ）冰 醋 酸 ） 2 瓶瓶/room$ MTT（$ 二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO) 5ml/组组第5页/共13页免疫血清分离过程摘眼球取血RT for 2hrsRotation3000rpm for 20minTransfer serum to a new EPDouble diffusionStore at 4ELISAm

4、l EP第6页/共13页实验步骤单细胞悬液的制备：1 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。1 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。1 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000lml EP管中。细胞计数：1 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20l，加到盛有980l计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。1 调细胞浓度至1107/ml，ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/mlA=1.51107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。第7页/

5、共13页细胞计数板细胞计数板 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y 104稀释倍数(50)4第8页/共13页细胞培养：1 按图所示加板。1 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%C02培养箱中，培养48小时。MTT掺入：（隔一天 下午2:00）1 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。1 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10l，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。1 在37 5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min，轻轻弃去上清，（注

6、意不要将孔底部的颗粒物弃出）。1 加入100l 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午4:00）结果测定：1 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录结果。1.结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值第9页/共13页预习内容 单克隆抗体的制备（理论P70，实验P106） 双向免疫扩散（理论P241，实验P116）第10页/共13页八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺每孔加入100 l调好的细胞悬液1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con A, 100 l 7-9孔加入5 g/ml的Con A, 100 l 10-12孔加入10 g/ml的Con A, 100 l NOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制N.S.OVAN.S.OVA 返回第11页/共13页八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺每孔加入100 l调好的细胞悬液1-3孔加入10%FCS-IMDM 培养液， 100 l 4-6孔加入2.5 g/ml的Con