微生物中的代谢足迹方法及在功能基因组和生物技术中的应用

1、微生物中的代谢足迹：方法及在功能基因组和生物技术中的应用 陈崇波 10808077 2009.05.13 valeria mapelli, lisbeth olsson and jens nielsenl 代谢足迹给我们提供了功能基因组学和菌株特性的一些重要信息 l 代谢足迹为科学家对细胞通讯，代谢工程和生物技术工艺的认识提供重要的方法 l 代谢足迹能够给我们提供一些关于胞内代谢情况的重要信息 l 从代谢足迹中得到的重要信息给能够帮助我们进一步破译代谢网络 在代谢组分析中提到的一些概念 代谢组：由细胞合成的，与代谢作用有关的一整套代谢物。代谢组由胞内代谢组和胞外代谢组构成。 代谢指纹：由核磁共

2、振或质谱分析获得的光谱图，提供由胞内代谢物得到的“印记”。一般地，代谢指纹并不提供对特定代谢物的定性或定量的检测。 代谢足迹：由核磁共振或质谱分析得到的光谱图，提供由胞外代谢物得到的“印记”。一般地，代谢足迹并不提供特定代谢物的定性检测，相反，它依赖于描述数据趋势的规律的发展，这些数据涉及到的只是少数的变量。对代谢指纹和代谢足迹的平行分析，能够显示胞内代谢物与胞外代谢物可能的相互联系，因此能帮助我们鉴定可能的新的代谢物功能。在代谢组分析中提到的一些概念 代谢物谱型：对一组特定的具有相似物理化学性质或代谢途径的代谢物进行定性和定量检测后的分析结果。 代谢物靶向分析：对感兴趣的一种或几种代谢物进行

3、定量的分析，忽略样本中出现的非靶向峰图。代谢足迹的分析工具直接喷射法质谱： 代谢样本直接喷射到离子源前，因此可以绕开色谱的分离。电喷射离子化质谱通常用于极性代谢物的检测，而大气压化学电离用于低极性和非极性代谢物的分析，其灵敏度还有待提高。直接喷射法质谱允许对原样品或样品的粗提物进行高通量的分析，一般每个样品需要1到3分钟。直接喷射法质谱的主要缺点是所谓的“基质效应”，它使得检测不同基质的样本在灵敏度和定量的准确度方面均有所下降 代谢足迹的分析工具质谱偶联： 它包含所有的这些分析技术，先对代谢物进行色谱分离再进行质谱分析，因此能对代谢物进行定性和定量的分析。在代谢组中，最常用的色谱分析技术是气相

4、色谱（气相色谱-质谱），还有经常用于靶向分析的高效液相色谱（高效液相色谱-质谱），另外还有毛细管电泳（毛细管电泳-质谱）。目前，飞行时间质谱分析器是代谢组分析的首选仪器，因为它具有全质量扫描能力和提供全部的质谱图，所以使得它对代谢物的检测具有很好的灵敏度。代谢足迹的分析工具 核磁共振法：核磁共振大量地应用于代谢组学的研究，得益于它的特异性和非选择性。这就意味着，我们观察到的每个共振对应于特异的化合物，它可提供一个样品中关于结构的丰富信息。核磁共振不需要分析的预筛条件，比如色谱分析的离子源或色谱分析的运行条件。 振动光谱法：傅里叶转换红外仪，是当前比较广泛应用的技术，可以获得生物样本的光谱指纹。

5、傅里叶转换红外仪具有快速、无需反应试剂，对复杂生物样本的非破坏分析等优点，因此，便于高通量筛选和无偏性的测定。该技术的主要缺点是灵敏度相对较低，这使得我们很难将得到的信心整合到生物信息当中去。胞外代谢物的自然角色l 在胞外微环境中，胞外代谢物水平的任何改变都会直接反映由体系中微生物活动而引起的环境的变化。 举个例子，营养会被消耗，许多胞外代谢物作为代谢活动的副产物会形成。此外，微生物所接触的环境的真实状况，会影响微生物的代谢状况，进而影响到释放到微环境中的代谢物。l 微生物能根据微环境进行精细的调控以最大化地利用自然资源。 举个例子，在厌氧条件下或在有氧条件，但存在氧化抑制剂情况下，啤酒酵母产

6、生乙醇，以维持合适的氧化还原的平衡。在厌氧条件下，啤酒酵母不能消耗它产生并释放到环境中的乙醇，但在有氧条件下，酵母能利用乙醇作为碳源，从而导致碱性厌氧代谢到有氧呼吸代谢的转换。 l 那些不是由细胞分泌或排出的代谢物（比如磷酸烯醇式丙酮酸，）在胞外的存在，可作为细胞溶解的一个标记，因此能够向我们提供细胞特定生长条件下的一些信息，比如ph，渗透压，它们能指示细胞内压力胞外代谢物的自然角色 此外，代谢物还具有重要的作用，这就是所说的细菌群感效应（qs），它依靠细胞感应胞外的代谢物。 细胞的群感效应是调控生物膜形成和其它生物学功能的机制。细菌能够分析特定的信号分子并感应它的浓度，当信号分子浓度达到阈值

7、是，细菌就能够引发包括致病基因在内的相关基因的表达，以适应环境的变化。胞外代谢组与胞内代谢组的偶联代谢足迹能带来的重要生物的信息代谢足迹的应用和可能的成果 通过代谢足迹进行细菌群感效应的研究 很多病原菌利用细菌群感效应（qs）机制来进行增值和攻击它们的宿主。 慢性疾病的感染主要原因是具有在生物膜系统中持续存在的能力，而这些生物膜系统通常是攻不破的，即使在抗生素的压力下，比如由菌绿假单胞菌引起的肺腑感染。在这些条件下，特异性地靶向靶向能诱导生物膜形成的qs分子，将是一种消灭微生物毒力的很有前景的方法，由于没有威胁到微生物的生存，因此降低了导致耐药性突变的选择压力的发生。然而，由于qs分子的性质和

8、作用方式的多样性，这些因素能改变依靠qs分子的浓度和感染情况，因此，qs分子拮抗物的设计可能不是很容易完成的工作。 代谢足迹的分析可提供一种从微生物群落胞外代谢物中，鉴定出潜在qs代谢物的有效方法 代谢足迹的应用和可能的成果 功能基因组学和菌株的鉴定 由于光谱技术在高通量应用方面的不断发展，还有与代谢指纹相比，代谢足迹比较容易获得，这使得代谢足迹成为一种在功能基因组研究中强有效的方法。酵母和大肠杆菌的不同基因突变，其基因是与代谢组密切相关的，则根据代谢足迹能成功地将它们区分开来。 这种方法依靠对小部分的差异（质谱峰）的鉴定，这些差异的变化有一个规律，就是它们与特定的突变有关。因此，代谢足迹能够

9、用于第一轮的分析，确定能区分归因于变异的质谱峰。 微生物菌种的快速鉴别不仅与功能基因组学有关，而且与工业生物技术有关，在工业生物技术中，新的高产菌株的鉴定具有重要的意义。举个例子来说，通过代谢足迹对啤酒酵母进行鉴别和分类，揭示了对那些由于基因组的内在复杂性，而不能在基因水平上区分的啤酒酵母菌株进行分类是可行的 代谢足迹的应用和可能的成果 新的代谢途径的发现和代谢工程 目前，相当多的工业研究兴趣聚焦在植物纤维的降解上，通过发酵的方法，将其作为原材料用于乙醇或其它燃料和化合物的生产。在这方面研究的一个主要目标是使植物多糖（纤维素和半纤维素）进行完全地降解成单糖（木糖和阿拉伯糖），理想的是不使用化学

10、试剂或只采用酶催化的方法。微生物和反应条件的优化仍有待于研究，但代谢足迹提供了一个重要的信息，使得我们能够通过鉴定胞外培养基中的降解产物来衡量降解的程度。 对来自于降解纤维素的微生物的胞外代谢物进行定性和定量的研究，能够提供针对瓶颈的重要线索和之前没被鉴别的微生物代谢途径。这些信息能与转录组学和蛋白组学的数据结合起来，进一步表征那些参与纤维降解的基因或相关的代谢途径。 代谢足迹还可以应用于生物修复。在生物修复领域，通过放射性同位素标记底物来跟踪异性生物质的不同降解途径，对代谢途径和可能的代谢抑制进行检测和表征，将得到进一步的改善。 代谢足迹的应用和可能的成果 生物过程的检测和开发 代谢足迹能带

11、来大量的生化信息，这些信息连同先进的自动分析技术的开发，使得代谢足迹成为一种能从工业水平上监测生物过程的诱人的方法。遍及不同的生物生长阶段，微生物的胞外代谢组发生根本的变化，各个不同的生长阶段可以用一特定的足迹来表征，这就意味着简单地通过读取相应的质谱峰图可以确定培养物的状况 对生物过程而言，代谢足迹更重要的另一个方面是，可以用它来检测细胞的生理状况和能够诱导胞内压力的环境条件。对于一给定的生物过程，代谢足迹可能有助于我们筛选最合适的菌株和生长条件，另外，通过代谢足迹，能够揭示细胞对环境压力和生物标记的存在的特殊反应，这些反应能暗示环境中有毒化合物的存在。举个例子来说，在废水生物处理的过程当中

12、，污泥培养物的代谢足迹，使得我们能够将存在于处理的水中不同类型的化学应力因素区分开来，比如镉，2,4-dnt和n-ethyl-maleimide，并且这种方法为微生物感应器的环境监测的开发铺平了道路。 代谢足迹的应用和可能的成果 高通量应用的一般过程和数据库 代谢足迹的一个主要的优点是它作为一种高通量的分析方法，使用简单，能同时用于实验室的研究和工业的就地生物处理过程。 另外，与代谢指纹相比，代谢足迹不需要任何复杂的操作程序，比如抑制（快速阻断）胞内代谢物，从代谢物从细胞中提取出来以及随后的处理以便于分析。对胞内代谢的真正分析前所需要的步骤的多寡，另外耗时长和高的成本，都可能影响结果的可靠性和可重复性，因此，较少的操作步骤也是代谢足迹的一个优势 为了把代谢足迹开发成适合高通量应用的代谢组技术，需要具有确定峰的标准图谱，因此从ms或nmr分析得到的峰模式才能被转译成相关的生物信息。基于此，详细的光谱数据库的建立，对所有代谢组的分析，都是非常重要的，但对高通量代谢足迹则尤为重要 结论 我们能从代谢足迹的分析中获得关于