酵母菌的分离及培养条件的优化

1、 设计型实验设计型实验 酵母菌的分离及培养酵母菌的分离及培养条件的优化条件的优化一、目的要求一、目的要求1、掌握培养基的配置及灭菌方法，能够正确的配制 培养基并在高压灭菌锅内进行灭菌。2、熟知培养基成分的选择原则，能够对培养基的成分和配比进行优化设计。3、掌握固体斜面、平板的制备技术，能够通过划线、涂布等方法分离菌种。4、熟知影响酵母菌生长繁殖各种培养条件，能够对摇瓶培养条件进行优化设计。5、了解酵母菌培养过程的代谢变化规律。掌握酵母菌培养过程参数的测定和分析方法。 二、基本原理二、基本原理 酵母菌是单细胞真菌生物，具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、b族维生素、核酸和矿物质，同时也能产

2、生一些保健功能活性物。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离纯化菌种常用到的方法。 在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件提供数据依据。 三、实验材料三、实验材料 （一）菌种：（一）菌种：从安琪酵母中分离的酵母菌 （二）培养基（二）培养基 基础培养基基

3、础培养基ypd： 酵母浸粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖 2% 固体培养 基再加琼脂2% 优化优化n源培养基：源培养基： 酵母浸粉1% (nh4)2so4 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% (nh4)2so4 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% nh4no3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% nh4no3 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% nano3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% nano3 4% 葡萄糖 2% ； （三）仪器设备（三）仪器设备 超净工作台，756型分光光度计，旋转式摇床，恒温培养箱，全自动灭菌锅，三角瓶、涂布器、移液管、平皿等玻璃仪器。 （四）试剂（四）试剂

4、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂 (nh4)2so4 2%、 (nh4)2so4 4%、 nh4no3 2% nh4no3 4%、 nano3 2%、 nano3 4%等；裴林试剂甲液、裴林试剂乙液； naoh溶液、hcl等。四四 实验内容实验内容1、分离单菌落、分离单菌落 （1）实验物品灭菌）实验物品灭菌 仪器：包扎9个移液管、9个涂布器、9个装有9ml蒸馏水的试管、16个平板、 液体：3g酵母浸粉1%、6g蛋白胨2%、6g葡萄糖2%，配成300ml溶液，取240ml溶液平均分装两个三角瓶中，然后每个三角瓶放入2.4g琼脂，剩下60ml为液体培养基，然后将以上设备拿去灭菌 （2）划线涂布）划线

5、涂布 超净台上：超净台上： 1、把240ml的培养基分别倒入15个平板，每个平板为1213ml，平板分别标10-210-10，还有倒一个斜面 2、取1ml的菌原液进行稀释梯度为10-310-10 3、划线涂布 划线为原液从10-210-7；涂布从10-310-10用对应的稀释梯度液，10-2用原液涂布2、种子培养挑取单菌落接至种子瓶，进行种子培养培养条件：将250ml三角瓶装培养基60ml放入摇床，将转速为180r/min,温度为30度培养时间:12月4号早上10:37到12月5号早上8:47十十个小时左右氮源的优化方案1.常见的有机氮源:(nh4)2so4.nh4no3.nano32.准备7

6、个三角瓶分别装入以下培养基然后定容至50ml(1) 1.酵母浸液0.5g (nh4)2so4 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g (nh4)2so4 2g 葡萄糖1g(2) 1.酵母浸液0.5g nh4no3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g nh4no3 2g 葡萄糖1g(3) 1.酵母浸液0.5g nano3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g nano3 2g 葡萄糖1g 3.对比试验:酵母浸液0.5g 蛋白胨1g 葡萄糖1g 4.配置完毕调ph值 ph等于5为准确 包三个移液管然后将以上培养基一起拿去灭菌接种培养 将种子液按9%的接种量接种到以下发酵瓶中 （nh4）

7、2so42%+5ml种子液 （nh4）2so44%+5ml种子液 nh4no32%+5ml种子液 nh4no34%+5ml种子液 nano32%+5ml种子液 nano34%+5ml种子液 蛋白胨+5ml种子液 培养培养 时间 9：20 条件180r/min 30的摇床测种子液的od值 将种子液稀释10倍，以ypd培养液为标准液测其od值 测得od值17.2%t取样取样 两小时后（两小时后（11：20） ph值均为6 od值: 稀释10倍 原液 (nh4)2so4 2% 0.117a 1.018a (nh4)2so4 4% 0.105a 0.863a nh4no3 2% 0.097a 0.88

8、9a nh4no3 4% 0.061a 0.830a nano3 2% 0.130a 0.845a nano3 4% 0.143a 0.836a 对照 0.178a 1.180a测发酵瓶的ph值od值及残糖量 一小时后（一小时后（12：30） ph值均为5 od值 稀释 原液 （nh4）2so4 2% 0.210a 1.066a （nh4）2so4 4% 0.167a 0.939a nh4no3 2% 0.192a 1.036a nh4no3 4% 0.106a 0.833a nano3 2% 0.167a 1.092a nano3 4% 0.161a 1.102a 对比 0.262a 1.3

9、28a 残糖量残糖量 空白 费林试剂a5ml+费林试剂b5ml+10ml水+6ml标准葡萄糖 样品 费林试剂a5ml+费林试剂b5ml+10ml水+0.5ml样品 测定结果 消耗标准葡萄糖 残糖量 （nh4）2so42% 7.08ml 1.744% （nh4）2so44% 6.5ml 1.86% 对比 6.98ml 1.764%结论 1、 经观察菌种生长发现稀释梯度为10-8、 10-9 的菌种进行涂布生长较好 2、 有机氮源比无机氮源效果好 (nh4)2so4比nh4no3、 nano3效果好 （nh4）2so4 2%比（nh4）2so4 4%效果好一、实训要求一、实训要求1、ypt培养基：

10、酵母菌1%，蛋白胨2%,葡萄糖2%；2、灭菌装料量60%；3、设定参数：ph=5，t=30，转速180r/min;4、接种与培养（接种量10%）注：（1 1）发酵罐是否正常运行、各参数；（2）随时间的延长适当调进气量、搅拌速度；（3）取样30min/次、镜检2h/次，样品进行两个平板培养。二、配制二、配制1、配多少培养基 10l罐装料量60%：10x60%=6l 接种量10%：培养基5400ml(实际操作培养基5000ml)，种子液600ml2、配方用多少 6l:60g酵母浸粉1%,120gc120g葡萄糖2%； 150ml:1.5g酵母浸粉1%,3g酵母浸粉1%,3g葡萄糖2%.其中100m

11、l加1g琼脂配成固体培养基用于倒平板；50g原液用于测od时做标准液。3、所需器材包扎灭菌 4个装有9ml蒸馏水的试管，6个空试管，4个涂布器，4个移液管1ml，6个平板1、nb型空气过滤器消毒型空气过滤器消毒 1.1在发酵罐空消前，必须对设备的nb型过滤器先进行消毒； 1.2为防止蒸汽冷凝水进入nb型过滤器，消毒前必须先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水，时间控制不少于5min； 1.3nb型过滤器的消毒温度控制在120-123之间，压力维持在0.11mpa-0.12mpa之间，时间确保在25min-30min之间； 1.4消毒后，在关闭蒸汽阀的同时迅速打开过滤器的进气阀换气，并用压缩空气将

12、过滤器吹干，吹干时间一般控制在25min-30min之间； 1.5吹干后，必须对整个空气进气系统进行保压，压力维持在0.12mpa-0.15mpa之间。 操作注意：空气流量计内不能通入蒸汽，nb过滤器消毒前必须将空气流量计出口阀关闭，以免造成设备损坏。2、设备空消2.1空消前，将控制系统退出自动运行状态，小心取出ph电极和do电极，进行清洗、校检、备用，并装好电极堵头。2.2打开夹套排污阀，同时打开夹套蒸汽阀进汽，在同时向罐内排光冷凝水之后，关闭夹套蒸汽阀，直至空消结束。2.3缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀进汽，待压力升至0.01mpa后，打开罐面排气阀进行排气。2.4调节罐面排气阀，保持罐压

13、0.01mpa,维持温度在120125之间，计时空消30min2.5空消完毕，关闭进气阀及底阀处的蒸汽阀，打开底阀开始排污。2.6开大罐面排气阀，卸去罐压后，打开罐盖上的进料口加入培养基。3 、加培养基、加培养基3.1 投料前，应校正并安装ph电极和od电极。3.2 按工艺要求配置好培养基原液，加入发酵罐内。3.3 加水定容至60%-65%左右后，启动电机搅拌5min 3.4 按工艺要求调整好ph后，拧紧进料口螺盖。 操作注意；实消时蒸汽冷凝水约占培养基体积10%左右，固定容是必须扣除此容积。 4 、培养基实消、培养基实消 4.1 投料结束后，启动电机。慢速搅拌。 4.2 微开夹套排污阀，打开

14、夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.11mpa左右，待培养基预热达到95 以上时停搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。 4.3 培养基温度达到95 后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内进气，待罐压升至0.11mpa后，打开罐面排气阀进行排气。 4.4 调节罐面排气阀，保持罐压0.11mpa，维持温度121 -123 之间，计时实消20min。 4.5 实消完毕，关闭底阀后关闭底阀处的蒸汽阀。 4.6 在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开nb型过滤器的出气阀，进行换气，保持罐压0.05mpa-0.08mpa之间。 4.7 关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀和夹套排污阀进行降温，当培养基温

15、度降到90 左右时，开搅拌低速控制。 4.8 当培养基温度达到发酵需要的温度后，关闭夹套手动进水阀，调整转速至正常转速，将控制系统切换至自动；运行状态，调整进风量、罐压，等待接种。 操作注意；因为调压过滤器出口空气压力在0.12mpa-0.15mpa之间，所以必须在发酵罐压力降至0.1mpa以下时方可进行唤起操作，且必须先换气后降温，防止设备失压。 5、接种、接种 5.1准备好合格的摇床菌种，接种量根据工艺要求确定。 5.2用75%酒精棉球擦洗进料口四周后，搁上接种火圈，并在接种火圈内围上酒精棉球，接种者双手也需用酒精棉球擦洗消毒。 5.3减少进气量，控制罐压在0.02mpa左右后，点燃接种火

16、圈内的酒精棉球。 5.4 拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的培养皿中。 5.5将接种瓶是瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。 5.6旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球将进料口擦洗干净。 5.7重新调整进风量，保持罐压在0.05mpa。 注意事项：操作中动作要迅速，罐压不得跌零，否则会导致染菌。 6、取样、取样 6.1打开取样放料阀处的蒸汽阀，微开取样放料阀，保持10min后关闭两阀门。 6.2打开底阀和取样放料阀，放出少量培养液后关闭取样放料阀。 6.3用酒精火焰封取取样放料口，把无菌取样瓶口置于酒精火焰上拔去瓶盖，打开取样放料阀取好样后，立即盖上瓶盖同时关闭底阀。 6.4再次打开取样处放料阀处的蒸汽阀，对取样放料阀口再灭菌，保持时间10min后关闭两阀。 注意事项：若不需要取无菌样时，可不进行酒精火焰保护的操作。整个培养过程的总取样量一般不超过发酵液体积的10%，否则诸如氧传递速度等会受到影响。 7、出料、出料 7.1调小罐面排气阀，调节进气