第七章微生物

1、遗传遗传： 亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异： 亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance）和变异（）和变异（variation）是生命的最本质特性之一）是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：表型表型：生物的全部遗传因子所携带的遗传信息生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表

2、型饰变：表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010-6-6-10-10-9-9）production of a red pigment (prodigiosin) by serratia marcescens. from left to right: slant cu

3、lture grown at 25c, slant culture grown at 37c, broth culture grown at 25c, broth culture grown at 37c. 微生物是遗传学研究中的明星：微生物是遗传学研究中的明星：t 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体， 方便建立纯系。方便建立纯系。t 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖。量生长繁殖。t 物种和代谢类型多样物种和代谢类型多样t 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，对环境因素的作用敏感，易于获得

4、各类突变株， 操作性强。操作性强。第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、三个证明一、三个证明dna是遗传物质的经典实验是遗传物质的经典实验1、经典转化实验、经典转化实验肺炎链球菌：肺炎链球菌：s型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力）致病能力） r型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）致病能力）1928年，年，f.griffth作了作了3组实验组实验:1944年，年，avery精确重复了转化实验，确定了转化因子精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明，将实验证明，将r菌转化为菌转化为s菌的转化因子是菌的

5、转化因子是dna2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验实验证明，进入实验证明，进入细菌细胞内部的细菌细胞内部的物质是物质是dna。dna包含有产生包含有产生完整噬菌体的全完整噬菌体的全部信息。部信息。3、植物病毒重建实验、植物病毒重建实验实验证明，遗传信息的流向与实验证明，遗传信息的流向与dna的传递是一致的。的传递是一致的。二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在（一）遗传物质在7个水平上的形式个水平上的形式1、细胞水平细胞水平2、细胞核水平细胞核水平3、染色体水平染色体水平4、核酸水平核酸水平5、基因水平基因水平6、密码子水平密码子水

6、平7、核苷酸水平核苷酸水平（二）微生物基因组结构的特点（二）微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组、原核生物（细菌、古生菌）的基因组1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的dna分子（单倍体）；分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rrn

7、a基因的多拷贝；基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短；）基因组的重复序列少而短；个别细菌个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的和古生菌的rrna和和trna中也发现有内含子或间插序列中也发现有内含子或间插序列2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在，分布在16条染色体中。条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；）有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 4）

8、重复序列多；）重复序列多；3、原核生物和真核生物的基因组比较、原核生物和真核生物的基因组比较（三）原核生物的质粒（三）原核生物的质粒1、定义、定义质粒（质粒（plasmid）：）：一种独立于染色体外，能进行自一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。的机能，从而使宿主得到生长优势。2、结构特点、结构特点通

9、常以共价闭合环状通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称，简称ccc)的超螺旋双的超螺旋双链链dna分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链dna质粒和质粒和rna质质粒；粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb； 细菌质粒多在细菌质粒多在10kb以内）以内）3、质粒的类型、质粒的类型严谨型质粒严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数低拷贝数松弛型质粒松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制

10、不同步，：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数高拷贝数窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）（可以在许多种细菌中复制）4、质粒在基因工程中的应用、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定）环状，稳定（3）独立复制）独立复制（4）拷贝数多）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选）存在标记位点，易筛选e. coli

11、的的pbr322质粒是一个常质粒是一个常用的克隆载体用的克隆载体5、质粒的检测、质粒的检测t 提取所有胞内提取所有胞内dna后电镜观察；后电镜观察；t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；t 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。6、质粒的主要种类、质粒的主要种类质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子致育因子（fertility factor，f因子）因子）抗性因子抗性因子（resistance factor，r因子）因子）产细菌素的质粒产细

12、菌素的质粒（bacteriocin production plasmid）毒性质粒毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒代谢质粒（metabolic plasmid）隐秘质粒隐秘质粒（cryptic plasmid）第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变 一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或dna序列的任何改变、可遗传、序列的任何改变、可遗传、自发或诱变产生自发或诱变产生基因突变基因突变狭义：点突变狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变广义：基因突变和染色体畸变野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型

13、（新性状）（一）突变类型（一）突变类型（二）突变率（二）突变率 每一世代中发生某一性状突变的几率每一世代中发生某一性状突变的几率（三）（三）基因突变的特点基因突变的特点 1、自发性、自发性 2、不对应性、不对应性 3、稀有性、稀有性 4、独立性、独立性 5、可诱变性、可诱变性 6、稳定性、稳定性 7、可逆性、可逆性（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验三个经典实验变量实验变量实验涂布实验涂布实验影印实验影印实验证明突变是自发产生证明突变是自发产生的，并且突变的性状的，并且突变的性状与引起突变的原因间与引起突变的原因间无直接对应关系。无直接对

14、应关系。野生型野生型（原始性状）（原始性状）特定环境特定环境突变型突变型（适应环境的新性状）（适应环境的新性状）驯化驯化定向定向诱变诱变筛选筛选？突变的原因突变的原因？（五）基因突变及其机制（五）基因突变及其机制1、诱发突变：物理、化学核生物的因素，提高突、诱发突变：物理、化学核生物的因素，提高突 变率的人为的作法变率的人为的作法（1）碱基的置换）碱基的置换碱基的置换引起的突变碱基的置换引起的突变（2）移码突变：添加或缺）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误失核苷酸，引起阅读错误- 错误错误+ 错误错误-+ 正常正常- 正常正常+ 正常正常（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位）染

15、色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位2、自发突变：无人为因素下的低频率突变原因：、自发突变：无人为因素下的低频率突变原因：（1）背景辐射）背景辐射（2）有害产物积累）有害产物积累（3）碱基错配）碱基错配（六）紫外线对（六）紫外线对dna的损伤及其修复的损伤及其修复嘧啶嘧啶嘧啶二聚体嘧啶二聚体uv1、光复活作用、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧啶嘧啶光解酶光解酶2、切除修复、切除修复二、突变与育种二、突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种： 选育选育 定向培育定向培育（二）诱变育种（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节、诱变育种的基本环节2、诱变育种的原则、诱变育种的原则（1）使用简

16、便有效的诱变剂）使用简便有效的诱变剂诱变剂诱变剂物理因素物理因素化学因素化学因素紫外线紫外线激光激光离子束离子束x射线射线r射线射线快中子快中子烷化剂烷化剂碱基类似物碱基类似物吖啶化合物吖啶化合物ames试验：试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用“生物化学统一性生物化学统一性”法则：法则：人和细菌在人和细菌在dna的结构及特性方面是一致的，能使微生物发的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然生突变的诱变剂必然也会作用于人的也会作用于人的dna，使其发生突变，最后造成癌变或其他，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。不良的后

17、果。诱变剂的共性原则：诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用的致癌物质对微生物有诱变作用90%90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用 美国加利福尼亚大学的美国加利福尼亚大学的bruce ames教授于教授于1966年发年发明，因此称为明，因此称为ames试验试验具体操作：检测具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变的回复突变率率

18、回复突变回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变证明证明ames试验重要性的应用实例：试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停反应停”，由于，由于其药效显著，在其药效显著，在60-7060-70年代十分流行，年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用的妇女大多曾服用“反应停反应停”，后来采用，后来采用amesa

19、mes试验发现这种物试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行但如果能在这种药物上市之前就进行amesames试验检测，那么这种试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量）使用最佳诱变剂量 剂量剂量 = 强度（浓度）强度（浓度） 作用时间作用时间 相对剂量相对剂量 = 杀菌率杀菌率（5）利用协同效应）利用协同效应（6）寻找和利用

20、形态、生理与产量间的相关指标）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案）设计高效率筛选方案（8）根据具体情况创造新型筛选方案）根据具体情况创造新型筛选方案3、突变株的筛选：（、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选突变株的筛选方法突变株的筛选方法诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检

21、出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）转化（一）转化供体菌供体菌受体菌受体菌dna片段片段1928年，年，griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae）的转化现象的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：1、建立了感受态的受体细胞、建立了感受态的受体细胞感受态细胞：感受态细胞：具有摄取外源具有摄取外源dna能力的细

22、胞能力的细胞 自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制；自身的基因控制； 人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取dnadna的的 能力，或人为地将能力，或人为地将dnadna导入细胞内导入细胞内2、外源游离、外源游离dna分子（转化因子）分子（转化因子）转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）噬菌体噬菌体dna被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染转染(transfection)：转染的特

23、点：转染的特点：提纯的噬菌体提纯的噬菌体dna以转化的（而非感染）途径以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。转化过程的特点：转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；）对核酸酶敏感；b）不需要活的）不需要活的dna供体细胞；供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多人工转化人工转化用用cacl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。

24、处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源种可以摄取外源dna的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；（二）细菌的转导（二）细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种

25、方式 一个细胞的一个细胞的dna通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍普遍转导转导局限局限转导转导完全普遍转导完全普遍转导流产普遍转导流产普遍转导低频转导低频转导高频转导高频转导局限转导与普遍转导的主要区别局限转导与普遍转导的主要区别溶源转变溶源转变（三）接合（三）接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程和重组过程1946年，年，joshua lederberg 和和edward l.taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重

26、营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。和重组所致。证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“u”型管型管实验（实验（ bernard davis，1950 ）接合机制接合机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为f因子的因子的质粒介导。质粒介导。f因子的分子量通常为因子的分子量通常为5107，上面，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的过程进行的20多个基因。多个基因。f因子为附加体质粒因子

27、为附加体质粒既可以脱离染色体在细既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上入（整合）到染色体上f f因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式 a）f-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，不含不含f因子，没有性菌毛，但可以通过因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收接合作用接收f因子而变成因子而变成f+菌株菌株；b）f+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)， f因子因子独立存在，细胞表面有性菌毛。独立存在，细胞表面有性菌毛。c c）hfrhfr菌株菌株，f f因子插入到染色体因子插入到染色体dnadna上上，细胞表面有性菌毛。，细胞表面有性菌毛。d d）ff菌株菌株，

28、hfr菌株内的菌株内的f因子因子因不正常切割而脱离染色体时，因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体形成游离的但携带一小段染色体基因的基因的f因子，特称为因子，特称为f因因 子。子。 细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。1） f+f-杂交杂交理化因子的处理可将理化因子的处理可将f因子消除而使因子消除而使f+菌株变成菌株变成f-菌株菌株f+菌株的菌株的f因子向因子向f-细胞转移，但含细胞转移，但含f因子的宿主细胞因子的宿主细胞的染色体的染色体dna一般不被转移。一般不被转移。a a）f f+ +细菌通过性毛与细菌通过性毛与f f- -细菌接触并发生细菌接触并发生相互作用；

29、相互作用；b b）f f+ +细菌的细菌的f f因子出现缺口，双链之一因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移被切断，从断端转移f f因子的一条链到因子的一条链到f f- -细菌中。细菌中。 c c）f f因子的一条链一进入因子的一条链一进入f f- -细菌中，就细菌中，就在在f f- -细菌中复制新的细菌中复制新的 f f因子。因子。d d）复制完成后，）复制完成后， f f- -细菌变成细菌变成f f+ + ，同时原有，同时原有f f+ +细胞也完成细胞也完成f f因子另一条链的复制，所因子另一条链的复制，所以转移是以转移是f f+ +的拷贝。的拷贝。所以最终所以最终杂交的结果杂交的结果是

30、是f f- -细菌变成细菌变成f f+ +细菌，而原有的细菌，而原有的f f+ +细菌则不变。细菌则不变。hfrhfr菌株的菌株的f f因子插入到染色体因子插入到染色体dnadna上，因此上，因此只要发生接合转只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给f f- -细细胞并发生重组，由此而得名为胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株高频重组菌株。2 2）hfr hfr f-杂交杂交hfr菌株仍然保持着菌株仍然保持着f+细胞的特征，具有细胞的特征，具有f性菌毛，性菌毛，并象并象f+一样与一样与f-细胞进行接合。细胞进行接合。所不同

31、的是，当所不同的是，当orit序列被缺刻螺旋酶识别而产序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，生缺口后，f因子的先导区因子的先导区(leading region)结合着结合着染色体染色体dna向受体细胞转移。向受体细胞转移。f因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此f因子不易转入受体细胞中。因子不易转入受体细胞中。hfrf-杂交后的受体细胞杂交后的受体细胞(或接合子或接合子)大多数仍然大多数仍然是是f-。染色体上越靠近染色体上越靠近f因子的先导区的基因，进入的机会就越多，因子的先导

32、区的基因，进入的机会就越多，在在f-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中断杂交（中断杂交（interrupted mating）技术）技术利用利用hfrf-的接合过程，的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间( (分钟分钟) )为为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。大肠杆菌基因组很大（大肠杆菌基因组很大（全部转移全部转移需要需要100分钟

33、分钟），其遗传图谱须用），其遗传图谱须用多株多株f因子整合在不同位置的因子整合在不同位置的hfr菌才能完成菌才能完成3 3）fff-杂交杂交hfr菌株内的菌株内的f因子因不正常切割而因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的一小段染色体基因的f因子，特称因子，特称为为f因子因子。ff-与与f+f-的不同：的不同：供体的部分染色体基因随供体的部分染色体基因随f一起转入受体一起转入受体细胞细胞a）与染色体发生重组；）与染色体发生重组；b）继续存在于）继续存在于f因子上，形成一种部分二因子上，形成一种部分二倍体；倍体；细胞基因的这种转移过程又常称

34、为细胞基因的这种转移过程又常称为性导性导（sexduction）、）、f因子转导因子转导（f-duction），或），或f因子媒介的转导因子媒介的转导（f-mediated transduction）。）。“接合接合” “转导转导” 及及“转化转化”这三种在自然界中存在的细这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：菌遗传重组过程各自的特点：外源外源dna的来源及进入途径有差异的来源及进入途径有差异（四）原生质体融合（四）原生质体融合二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组（一）有性杂交（一）有性杂交细胞（细胞（ ）细胞（）细胞（）有性接合有性接合 染色体重组染色体重组 新遗传型

35、新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交（二）准性杂交（二）准性杂交细胞（细胞（ ）细胞（）细胞（）准性接合准性接合 基因重组基因重组 新遗传型新遗传型菌丝联结菌丝联结 质配质配 核配核配 有丝分裂交换有丝分裂交换 单倍体杂合子单倍体杂合子在半知菌类中最为常见在半知菌类中最为常见半半知知菌菌的的准准性性生生殖殖准性杂交育种准性杂交育种第四节第四节 基因工程基因工程特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性一、基因工程一、基因工程定义：定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使在基因水平上，改

36、造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。生物新品系。获得目的基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外源基因导入（细菌、外源基因导入（细菌、植物植物、动物动物、基因枪基因枪）筛选和鉴定筛选和鉴定应用应用二、基因工程的基本操作二、基因工程的基本操作第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a

37、）变异；）变异；b）污染；）污染； c）死亡。）死亡。一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种纯菌种自发突变自发突变不纯菌种不纯菌种突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体衰退衰退菌种菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状衰退：菌种出现或表现出负变性状1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离；）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮；）通过寄主体进行复壮；2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，

38、在）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。菌种的复壮：菌种的复壮：二、防止衰退的措施二、防止衰退的措施1）减少传代次数；）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；三、菌种保藏三、菌种保藏目的目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用以供研究、生产、交

39、换之用基本原则基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）干燥、低温） 4、尽可能多的采用不同的手段保藏、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株一些比较重要的微生物菌株基本方法基本方法培养基传代培养（培养基传代培养（斜面、平板）斜面、平板）寄主传代培养寄主传代培养低温（低温（液氮、低温冰箱）液氮、低温冰箱）干燥（干燥（沙土管、真空干燥）沙土管、真空干燥）生活态生活态休眠态休眠态冷冻干燥保藏法和液氮保藏法冷冻干燥保藏法和液氮

40、保藏法1、细胞水平、细胞水平真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平、细胞核水平真核生物真核生物 细胞核细胞核 核染色体核染色体原核生物原核生物 核区核区 dna链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质3、染色体水平、染色体水平染色体是由组蛋白与染色体是由组蛋白与dna构成的线状结构构成的线状结构染色体的数目在不同的生染色体的数目在不同的生物中是不同的物中是不同的染色体的倍数在同一生物染色体的倍数在同一

41、生物的不同生活时期是不同的的不同生活时期是不同的4、核酸水平、核酸水平核酸种类：核酸种类：dna，rna核酸结构：双链、单链；核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状环状，线状，超螺旋状dna长度：因种而异长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。研究微生物学的最有力的手段。5、基因水平、基因水平6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位核苷酸是最小突变单位和交

42、换单位（1）致育因子）致育因子(fertility factor，f因子因子)又称又称f质粒，其大小约质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象的有性生殖现象（接合作用）（接合作用）有关的质粒。有关的质粒。携带携带f质粒的菌株称为质粒的菌株称为f+菌株菌株（相当于雄性），无（相当于雄性），无f质粒的质粒的菌株称为菌株称为f-菌株（相当于雌菌株（相当于雌性）。性）。f因子能以游离状态因子能以游离状态(f+)和和以与染色体相结合的状态以与染色体相结合的状态(hfr)存在于细胞中，所以存在于细胞中，所以又称之为附加体又称之为附加体(episom

43、e)。（2）抗性因子（）抗性因子（resistance factor，r因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称包括抗药性和抗重金属二大类，简称r质粒。质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。r质粒质粒抗性转移因子（抗性转移因子（rtf）：转移和复制基因：转移和复制基因抗性决定因子抗性决定因子：抗性基因：抗性基因r100质粒质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion ，mer）四环素（四环素（tetracycline，tet ）链霉素链霉素

44、(streptomycin, str)、磺胺磺胺(sulfonamide, su)、氯霉素氯霉素(chlorampenicol, cm)、夫西地酸（夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。细菌素细菌素抗生素抗生素抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌较广的抗菌谱通过核糖体直接合成的多肽类物质通过核糖体直接合成的多肽类物质一般是次级代谢产物编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上于质粒或转座子上一般无直接的结构基

45、因，相关酶的基因多在染色体上（3）产细菌素的质粒（）产细菌素的质粒（bacteriocin production plasmid）一般都位于一般都位于质粒或转座质粒或转座子上，因此，子上，因此，细菌素可以细菌素可以杀死同种但杀死同种但不携带该质不携带该质粒的菌株。粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（e. coli）产生的细菌素为）产生的细菌素为colicins（大肠杆（大肠杆菌素），而质粒被称为菌素），而质粒被称为col质粒。质粒。细菌素结构基因涉及细菌素运输及细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主发挥作用

46、的蛋白质的基因赋予宿主对该细菌素具有对该细菌素具有“免疫力免疫力”的相关的相关产物的基因产物的基因（4）毒性质粒（）毒性质粒（virulence plasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码苏云金杆

47、菌含有编码内毒素内毒素(伴伴孢晶体中孢晶体中)的质粒的质粒根癌土壤杆菌所含根癌土壤杆菌所含ti质粒是引起双子叶植物冠质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子瘿瘤的致病因子ti质粒质粒中的中的t-dna可携带任何外源基因整合到植物基可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体（5）代谢质粒（）代谢质粒（metabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。线菌）等。

48、将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。，环境保护方面具有重要的意义。降解质粒：降解质粒：假单胞菌：假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物如芳香簇化合物(苯苯)、农、农药药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能、辛烷和樟脑等的能力。力。（6）隐秘质粒（）隐秘质粒（cryptic plasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳

49、检测细胞抽提液等方法才能发现。的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）（一般加上抗性基因）变量实验（变量实验（fluctuation analysis）salvador luria and max delbruck（1943）salvador luriamax delbruckthe nobel prize in physiology or medicine 1969变量实验（变量实验（

50、fluctuation analysis）newcombe的涂布实验（的涂布实验（1949）影印实验（影印实验（replica plating ）joshua lederberg and esther lederberg（1952）joshua lederbergj. lederberg is awarded the noble prize in j. lederberg is awarded the noble prize in medicine and physiology in 1958medicine and physiology in 1958普遍转导（普遍转导（generalize

51、d transduction）噬菌体可以转导噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分供体菌染色体的任何部分到受体细胞中到受体细胞中的转导过程的转导过程普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源dna被降解，转导失败。被降解，转导失败。进入受体的外源进入受体的外源dna通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子而形成稳定的转导子流产转导流产转导完全普遍转导完全普遍转导转导转导dna不能进行整合、重组和复制，但其携带的基不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有因此群体中仅一个细胞含有dna，而其它细胞只能得，而其它细胞只能得到其基因产物，到