细胞凋亡与疾病-高级病生

1、 何何 芳芳 教教 授授石河子大学医学院病理生理学教研室石河子大学医学院病理生理学教研室 20132013年年9 9月月 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（apoptosis and disease） 概述概述 凋亡时细胞的主要变化凋亡时细胞的主要变化 细细胞凋亡过程与调控胞凋亡过程与调控 细细胞凋亡的发生机制胞凋亡的发生机制 细胞凋亡常用的研究方法细胞凋亡常用的研究方法 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病一一. .概述概述n( (一一) )凋亡概念的提出凋亡概念的提出 19651965年澳大利亚年澳大利亚科学家发现，结扎鼠科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一门静脉后，电镜观察到肝实质

2、组织中有一些散在的死亡细胞，显然不同于细胞坏死。些散在的死亡细胞，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。19721972年年kerrkerr等等三位科学家首次提出了细胞三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念。凋亡的概念。n apoptosis ( (细胞凋亡细胞凋亡) )：由体内由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡，细胞凋亡，又称又称programmed cell death,pcd

3、( (程序性细胞死亡程序性细胞死亡) )( (二二) )细胞凋亡的研究历史细胞凋亡的研究历史1.1972-19871.1972-1987：细胞凋亡的形态学及生物化：细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段学研究阶段：1 1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。的研究。2 2）染色体）染色体dnadna的降解。的降解。3 3）rna/rna/蛋白质大分子的合成。蛋白质大分子的合成。4 4）钙离子变化。）钙离子变化。 5 5）内源性核酸内切酶。）内源性核酸内切酶。2.2.细胞凋亡的分子生物学研究阶段细胞凋亡的分子生物学研究阶段: :1 1）细胞凋亡的相关基因

4、及调控）细胞凋亡的相关基因及调控2 2）细胞凋亡的信号转导）细胞凋亡的信号转导3 3）细胞凋亡的各种分子及其相互作用）细胞凋亡的各种分子及其相互作用3.3.细胞凋亡的临床应用基础研究阶段细胞凋亡的临床应用基础研究阶段(三三)细胞凋亡生物学意义细胞凋亡生物学意义确保正常发育、生长。确保正常发育、生长。维持内环境稳定。维持内环境稳定。发挥积极的防御功能。发挥积极的防御功能。二二. .凋亡时细胞的主要变化凋亡时细胞的主要变化 ( (一一) )形态学改变形态学改变 正常正常细胞细胞凋亡小体凋亡小体吞噬细胞吞噬细胞坏死坏死凋亡凋亡细胞凋亡与细胞坏死的比较细胞凋亡与细胞坏死的比较1) 细胞间连接丧失；细胞

5、间连接丧失；2）胞体固缩；）胞体固缩；3）细胞器完整；）细胞器完整；4）核固缩；）核固缩；5）染色质边集；）染色质边集；6）凋亡小体形成）凋亡小体形成1、凋亡的主要形态学变化、凋亡的主要形态学变化 表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接触。触。 细胞体积逐渐缩小，细胞体积逐渐缩小，出现固缩出现固缩(condensation)(condensation)。 胞浆脱水，胞膜迅速发生胞浆脱水，胞膜迅速发生空泡化空泡化(blebbing)(blebbing)。 内质网扩张并与胞膜融合，形成内质网扩张并与胞膜融合，形成出芽出芽(buding)(buding)

6、现象。现象。 晚期出现晚期出现染色质边集染色质边集(margination)(margination)。 线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。 形成凋亡小体形成凋亡小体(apoptosis body),(apoptosis body),这是凋亡细胞这是凋亡细胞 特征的形态学改变。特征的形态学改变。*2、细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡与坏死的比较坏坏 死死 凋凋 亡亡 诱导因素诱导因素 强烈刺激，随机发生强烈刺激，随机发生 较弱刺激，非随机发生较弱刺激，非随机发生 生化性质生化性质 病理性，非特异性病理性，非特异性 生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性 特点

7、特点 被动过程，无新蛋白被动过程，无新蛋白 主动过程，有新蛋白合成，主动过程，有新蛋白合成， 合成合成, ,不耗能，不耗能， 耗能耗能 形态变化形态变化 细胞结构全面溶解、细胞结构全面溶解、 胞膜及细胞器相对完整，细胞膜及细胞器相对完整，细 破坏、细胞肿胀破坏、细胞肿胀 胞皱缩，核固缩胞皱缩，核固缩 dnadna电泳电泳 弥散性降解，电泳呈弥散性降解，电泳呈 dnadna片段化片段化(180-200bp)(180-200bp)，电，电 均一均一dnadna片状片状 泳呈泳呈“梯梯”状条带状条带 炎症反应炎症反应 溶酶体破裂，局部炎溶酶体破裂，局部炎 溶酶体相对完整，局部无炎症溶酶体相对完整，局

8、部无炎症 症反应症反应 反应反应 凋亡小体凋亡小体 无无 有有 基因调控基因调控 无无 有有 3、 细胞凋亡、细胞凋亡、pcd的区别的区别 特征特征 pcd pcd 细胞凋亡细胞凋亡 形态学形态学 细胞固缩，裂成小体细胞固缩，裂成小体 同左同左 膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 同左同左 线粒体线粒体 常有阵发的自噬作用常有阵发的自噬作用 无变化无变化 染色质染色质 凝聚，电子致密度加大凝聚，电子致密度加大 着边着边 自噬作用自噬作用 常有，但并非一定发生常有，但并非一定发生 无无 潜伏期潜伏期 几小时几小时 几分钟到几小时几分钟到几小时 蛋白质合成蛋白质合成 放线菌素放线菌素d d及放

9、线菌酮及放线菌酮 放线菌素放线菌素d d及放线及放线 阻断死亡阻断死亡 有时阻断死亡有时阻断死亡 胞浆生化变化胞浆生化变化 溶酶体酶活性有时增加，溶酶体酶活性有时增加， 溶酶体增加，溶酶体增加，c-myc,c-myc, 偶有热休克蛋白、偶有热休克蛋白、c-mycc-myc， c-fos?c-fos? c-fos c-fos 核核dnadna电泳电泳 无梯状无梯状dna dna 梯状梯状dnadna图谱图谱 首先的表现首先的表现 蛋白质合成下降，方式改变蛋白质合成下降，方式改变 内源性核酸酶活化内源性核酸酶活化4 4、细胞凋亡与胀亡的比较细胞凋亡与胀亡的比较胀亡胀亡 凋凋 亡亡 早期早期 细胞肿

10、胀波及胞内结构细胞肿胀波及胞内结构 细胞皱缩、体积缩小、胞浆浓缩细胞皱缩、体积缩小、胞浆浓缩 胞浆疏松化并且有空泡形胞浆疏松化并且有空泡形 及出芽改变及出芽改变 成体积增大成体积增大 形态变化形态变化 胞膜完整性破坏、胞膜完整性破坏、 胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞器相对完整 细胞器崩解细胞器崩解 dnadna电泳电泳 非特异性非特异性 dnadna片段化片段化(180-200bp)(180-200bp)，电，电 dnadna片段片段 泳呈泳呈“梯梯”状条带状条带 炎症反应炎症反应 周围明显炎周围明显炎 溶酶体相对完整，局部无炎症溶酶体相对完整，局部无炎症 症反应症反应 反应反应 凋亡小体凋亡

11、小体 无无 有有 1997年美国毒理病理学会细胞死亡命名委员会将细胞死亡年美国毒理病理学会细胞死亡命名委员会将细胞死亡途径分为凋亡和胀亡（途径分为凋亡和胀亡（oncosis）( (二二) )细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变1.dna1.dna的片段化：判断凋亡发生的客观的片段化：判断凋亡发生的客观指标之一指标之一 内源性核酸内切酶作用引起的内源性核酸内切酶作用引起的dnadna断裂产生断裂产生的单链缺口优先发生于核小体连接区，使的单链缺口优先发生于核小体连接区，使dnadna断断裂成核小体倍数大小的片段裂成核小体倍数大小的片段, , 即即180-200bp180-200bp倍数倍数大小的片

12、段大小的片段, , 在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯状梯状dnadna区带。区带。 1.1. 凋亡早期即发生；凋亡早期即发生；2.2. 核小体间连接部位断裂成核小体间连接部位断裂成180180200bp200bp整倍数片段；整倍数片段； 3.3. 染色质染色质dnadna单链断裂。单链断裂。2.2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用(ca(ca2+2+/mg/mg2+2+) ) dnase dnase、dnase (ph=6.2dnase (ph=6.2左右）左右） ,topo ,topo 、 topo topo （解旋）（解旋） （1 1）

13、caspases caspases 的结构的结构 结构结构:caspase:caspase成员都具有相似的氨基酸序成员都具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，正常时它们都以酶原列、结构和底物特异性，正常时它们都以酶原（30-50kd30-50kd）形式存在，包括三个结构域：一个）形式存在，包括三个结构域：一个n n末端原结构域，一个大亚基（末端原结构域，一个大亚基（20kd20kd），一个小亚），一个小亚基（基（10kd10kd）。）。3. caspases 3. caspases 激活激活（2 2）caspasescaspases特点：特点：活性中心半胱氨酸活性中心半胱氨酸在催化底物时，总

14、是在天冬氨酸残基的在催化底物时，总是在天冬氨酸残基的c c端裂解端裂解底物底物 caspases caspases酶原的活性很低，需要切除氨基端的酶原的活性很低，需要切除氨基端的一段序列才能被激活一段序列才能被激活活化的活化的caspasescaspases能够特异水解一套蛋白底物能够特异水解一套蛋白底物, ,从而导致细胞凋亡从而导致细胞凋亡 细胞内细胞内caspasescaspases与其抑制剂总是共存，以免与其抑制剂总是共存，以免caspasescaspases酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤（3 3）caspasescaspases分类：分类：根据大小

15、亚单位序列的同源性以及功能根据大小亚单位序列的同源性以及功能: :细胞因子处理组：细胞因子处理组：1 1，4 4，5 5，1111，1212，1313，1414凋亡起始组：凋亡起始组：2 2，8 8，9 9，1010凋亡效应组：凋亡效应组： 3 3，6 6，7 7，(4) (4) caspasecaspase的活化的活化: :前体的前体的n-n-端前肽和大亚端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除基之间的特定位点被水解去除n-n-端前肽，然后再端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有小亚基组成异源

16、二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。活性的四聚体。 （5 5）激活方式：）激活方式：自活化（自活化（autoactivationautoactivation）: :长长原原结构域结构域( (caspases-8,10)转活化（转活化（transactivationtransactivation）: :短原结构域短原结构域(caspases-3,6,7)连接调节亚单位激活连接调节亚单位激活: :(caspases-9)非非caspasecaspase蛋白酶的活化蛋白酶的活化 （activation by activation by non-caspase proteinasesnon-ca

17、spase proteinases）: :细胞毒性细胞毒性t t淋巴细淋巴细胞的颗粒酶胞的颗粒酶b(b(caspase -3,7,8,910 ） ，组织蛋白酶，组织蛋白酶g (g (caspase -7 ） apaf-1（5 5）激活方式：）激活方式：自活化（自活化（autoactivationautoactivation）: :长长原原结构域结构域( (caspases-8,10)转活化（转活化（transactivationtransactivation）: :短原结构域短原结构域(caspases-3,6,7)连接调节亚单位激活连接调节亚单位激活: :(caspases-9)非非casp

18、asecaspase蛋白酶的活化蛋白酶的活化 （activation by activation by non-caspase proteinasesnon-caspase proteinases）: :细胞毒性细胞毒性t t淋巴细淋巴细胞的颗粒酶胞的颗粒酶b(b(caspase -3,7,8,910 ） ，组织蛋白酶，组织蛋白酶g (g (caspase -7 ） （6 6）目前已知的）目前已知的caspasecaspase功能有：功能有： 灭活凋亡抑制蛋白。灭活凋亡抑制蛋白。 直接作用于细胞结构，裂解核纤层，使核纤直接作用于细胞结构，裂解核纤层，使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。层蛋

19、白崩解，导致细胞染色质的固缩。 分解与细胞骨架构成相关的蛋白其中包括凝分解与细胞骨架构成相关的蛋白其中包括凝胶原蛋白（胶原蛋白（gelsingelsin）、聚合粘附激酶（）、聚合粘附激酶（focal focal adhesion kinase ,fakadhesion kinase ,fak）、）、p21p21活化激酶活化激酶（pakpak）等，引起细胞结构重组、凋亡。）等，引起细胞结构重组、凋亡。caspasecaspase可使一些与可使一些与dnadna修复、复制和修复、复制和mrnamrna缝缝结有关的蛋白的调节区和催化区解离，瓦解核结构结有关的蛋白的调节区和催化区解离，瓦解核结构，使细

20、胞降解为凋亡小体。，使细胞降解为凋亡小体。 (7)caspase(7)caspase的抑制剂：的抑制剂：病毒性抑制剂：病毒性抑制剂：n1)1)牛痘病毒蛋白牛痘病毒蛋白crmacrma（cytokine response cytokine response modifier amodifier a）：直接作用于成熟）：直接作用于成熟caspasecaspase活活性位点性位点 有效抑制有效抑制caspase1caspase1，4 4，6 6，8 8，对，对caspase2caspase2，3 3，7 7，1010效果差效果差n2)p35:2)p35:以竞争性结合的方式与靶分子形成稳以竞争性结合的

21、方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体定的具有空间位阻效应的复合体肽类抑制剂：肽类抑制剂：nac-devd.cho,acyvad.cho,z-vad.fmkbcl-2bcl-2蛋白家族：蛋白家族：其他其他:no:no及其相关分子，锌及其相关分子，锌3)3)杆状病毒蛋白杆状病毒蛋白iapiap（inhibitor of apoptosis inhibitor of apoptosis family proteinfamily protein，7 7种），不是活性位点特异性抑种），不是活性位点特异性抑制剂制剂4)v-flip4)v-flip：包含两个：包含两个dedded，与，与caspa

22、secaspase竞争结合死亡竞争结合死亡受体复合物受体复合物5)5)蛋白蛋白hbxhbx（乙肝病毒编码）：（乙肝病毒编码）： caspase-3caspase-3 4 4、大分子合成、大分子合成 n(1)(1)细胞凋亡需要细胞凋亡需要rnarna和（或）蛋白质的合成，和（或）蛋白质的合成，大分子合成抑制剂可阻断细胞凋亡；大分子合成抑制剂可阻断细胞凋亡；n(2)(2)细胞凋亡发生前所需生物大分子已存在于细细胞凋亡发生前所需生物大分子已存在于细胞内，只是被分割开来或以无活性状态存在，胞内，只是被分割开来或以无活性状态存在，其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些离子的存其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些离

23、子的存在在, ,除非有活化信号传入，它们对细胞并不造成除非有活化信号传入，它们对细胞并不造成损害，这种情况下细胞凋亡不受蛋白质或损害，这种情况下细胞凋亡不受蛋白质或rnarna合合成抑制剂的影响；成抑制剂的影响； n(3)(3)细胞内已有凋亡所需的大分子物质，细胞内已有凋亡所需的大分子物质，只是其功能被其它生物大分子（如只是其功能被其它生物大分子（如bcl-2bcl-2）的连续合成所抑制，此时蛋白质或的连续合成所抑制，此时蛋白质或rnarna合合成抑制剂能促进细胞凋亡的发生。成抑制剂能促进细胞凋亡的发生。n5 5、钙离子的动员、钙离子的动员内钙释放外钙内流 ca2+i增加增加 内钙释放和外钙内

24、流途径钙池ca2+引起细胞凋亡的机制引起细胞凋亡的机制线粒体线粒体肌浆网肌浆网损伤刺激损伤刺激肌浆肌浆caca2+2+钙蛋白酶钙蛋白酶染色质染色质 凝集凝集磷脂酶磷脂酶磷脂分解磷脂分解谷氨酰胺谷氨酰胺转移酶转移酶骨架蛋骨架蛋白破坏白破坏核酶核酶染色体染色体 损伤损伤似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡; ;危难中的

25、细胞啊，危难中的细胞啊，你沉稳不乱，你沉稳不乱，dna片片切割，片片切割，化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。 三三. .细胞凋亡过程与调控细胞凋亡过程与调控凋凋亡亡诱诱导导因因素素受受体体campca2+神经酰胺神经酰胺凋亡信号转导凋亡信号转导+dnase激活激活caspases激活激活细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行死

26、亡信号死亡信号凋亡凋亡相关相关基因基因激活激活凋亡基因激活凋亡基因激活巨噬细胞巨噬细胞吞噬分解吞噬分解凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除( (一一) )细胞凋亡过程细胞凋亡过程凋亡过程凋亡过程受体受体campca2+神经酰胺神经酰胺凋亡相关凋亡相关基因激活基因激活信信号号转转导导细胞膜细胞膜细胞核细胞核凋亡诱导因素凋亡诱导因素+dnase激活激活caspases激活激活死亡信号死亡信号apoptosisapoptosis凋亡过程与调控凋亡过程与调控凋亡过程凋亡过程执行凋亡执行凋亡凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除dnase激活激活caspases激活激活(二二)细细 胞胞 凋凋 亡亡 的的

27、 调调 控控1.1.细胞凋亡的诱导与抑制细胞凋亡的诱导与抑制 2.2.细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导(transduction)(transduction) 多样性多样性 偶联性偶联性 同一性同一性 多途性多途性 死亡受体是一组死亡受体是一组tnftnf受体基因超家族的成员，受体基因超家族的成员，包括包括fas(cd95,apo1)fas(cd95,apo1)，tnfr1(p55,cd120a)tnfr1(p55,cd120a)，死亡，死亡受体受体dr3 dr3 、dr4dr4、dr5dr5等。其结构特点为胞外区有一等。其结构特点为胞外区有一半胱氨酸富集结构域半胱氨酸富集结构域(cyst

28、ein-rich domain)(cystein-rich domain)，胞，胞内区有一死亡结构域内区有一死亡结构域(death domain, dd)(death domain, dd)。它们是。它们是一组膜蛋白，一组膜蛋白，与与faddfadd结合，而结合，而faddfadd的聚集则通过其的聚集则通过其死亡效应区死亡效应区(death effect domain,ded)(death effect domain,ded)激活激活caspase-8caspase-8。 (1)(1) 死亡受体途径死亡受体途径 fasfas配体配体( (凋亡信号凋亡信号) ) fas(dr)fas(dr) 细

29、胞膜细胞膜 fas(death domain)fas(death domain) fadd(fas-associated fadd(fas-associated death domain) death domain)caspase-8(2)线立体途径线立体途径:smase鞘磷脂鞘磷脂神经酰胺神经酰胺(ceramide)磷 酸 胆 碱磷 酸 胆 碱 (phosphocholine)tnf、糖皮质、糖皮质激素、电离辐射、激素、电离辐射、紫外线紫外线(3)(3)以神经酰胺为第二信使介导的细胞以神经酰胺为第二信使介导的细胞凋亡凋亡 (4)dag/pkc系统系统n(5)camp /pka信号系统信号系统

30、 pkapka使关键的蛋白质使关键的蛋白质分子发生不同程度的磷酸分子发生不同程度的磷酸化，进而影响内源性核酸化，进而影响内源性核酸内切酶的活性，在研究糖内切酶的活性，在研究糖皮质激素诱导胸腺细胞凋皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时，即发现亡时，即发现campcamp和内源和内源性核酸内切酶与细胞凋亡性核酸内切酶与细胞凋亡呈正相关的现象。呈正相关的现象。n(6)胞内胞内ca2+ 信号系统信号系统3.3.凋亡相关基因凋亡相关基因(1)bcl-2(1)bcl-2及其相关基因：及其相关基因： b b 细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/ /白血病白血病-2-2（b cell b cell lymphoma/leukemia

31、-2lymphoma/leukemia-2），）， 19841984年从滤泡性淋巴年从滤泡性淋巴瘤发现，存在于核膜和线粒体。瘤发现，存在于核膜和线粒体。19881988年首次证实年首次证实bcl-2bcl-2基因的高表达可引发肿瘤，基因的高表达可引发肿瘤，bcl-2bcl-2家族至少家族至少有有1515个成员。个成员。1)1)抑制凋亡抑制凋亡bcl-2bcl-2亚族：亚族：bcl-2bcl-2、mcl-1mcl-1、bcl-wbcl-w等等, ,存在于线存在于线粒体膜上。粒体膜上。抗凋亡的主要机制是：抗凋亡的主要机制是： 直接的抗氧化直接的抗氧化 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋

32、亡的蛋白质 抑制促凋亡调节蛋白抑制促凋亡调节蛋白baxbax、bakbak的细胞毒的细胞毒作用作用 抑制凋亡蛋白酶抑制凋亡蛋白酶(caspases)(caspases)的激活的激活 维持细胞钙稳定维持细胞钙稳定 2)促进凋亡促进凋亡bax亚族：亚族：bax、bak、bad、bik、bid等，存在于线粒体膜上和内质网膜上。等，存在于线粒体膜上和内质网膜上。bax与与bcl-2相关蛋白很高的同源性，编码三个蛋白：相关蛋白很高的同源性，编码三个蛋白：bax-、bax-和和bax-。bcl-2与与bax的比率不同也可影响细的比率不同也可影响细胞凋亡。胞凋亡。3)bcl-x： bcl-xl(241氨基酸

33、氨基酸):与与bcl-2同源性同源性74% bcl-xs(178,少少63) bcl-2家族成员家族成员p53p53基因基因wtp53wtp53 修复受损的修复受损的dnadna，如修复失败则诱导细胞凋亡，如修复失败则诱导细胞凋亡突变的突变的p53p53失活的失活的p53p53丧失监视丧失监视dnadna损伤的功能损伤的功能射线，毒素射线，毒素p53p53蛋白蛋白+细胞凋亡细胞凋亡促进凋亡基因促进凋亡基因(mtp53）双向调控基因双向调控基因 c-mycc-myc是一种癌基因，是调控细胞周期的主要是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码的蛋白是基因。编码的蛋白是dnadna结合蛋白，调控基

34、因转结合蛋白，调控基因转录，在录，在gfgf充足时主要激活介导细胞增殖的基因；充足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。反之激活凋亡基因。 c-myc促进凋亡基因促进凋亡基因抑制凋亡基因抑制凋亡基因 双向调控基因双向调控基因fas bax ice p53c-mycbcl-x eib、iap、bcl-2 凋亡相关基因凋亡相关基因正常正常细胞细胞 调控细胞凋亡的调控细胞凋亡的某些基因间的相互某些基因间的相互关系关系ice 、w tp53 细胞凋亡细胞凋亡 ice促进促进 bax 、c-myc 、fas抑制抑制 bcl-2mtp53 凋亡凋亡 wtp53 bcl-2 bax 诱导和抑制诱导

35、和抑制细胞凋亡基细胞凋亡基因因四四. .细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制( (一一) )氧化损伤在细胞凋亡中的作用氧化损伤在细胞凋亡中的作用( (二二) )钙稳态失衡钙稳态失衡(calcium dyshomeostasis)(calcium dyshomeostasis)( (三三) )线粒体损伤在细胞凋亡中的作用线粒体损伤在细胞凋亡中的作用( (一一) )氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是：氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是： 氧自由基引起的氧自由基引起的dnadna损伤可激活损伤可激活p53p53基因。基因。 氧自由基引起的氧自由基引起的dnadna损伤可活化聚损伤可活化聚adpadp核糖

36、核糖 转移酶，引起转移酶，引起nadnad快速耗竭，快速耗竭，atpatp大量消耗。大量消耗。 氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸， 引起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可引起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可 诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡。 氧化应激可激活氧化应激可激活caca2+2+/mg/mg2+2+依赖的核酸内切酶，依赖的核酸内切酶，也可产生膜的发泡现象。也可产生膜的发泡现象。 氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使胞膜的通透性使caca2+2+内流增加，诱导细胞凋亡。内流增加，诱导细胞凋亡。 自由基对线

37、粒体膜损害导致其通透性和膜电位自由基对线粒体膜损害导致其通透性和膜电位的变化诱导细胞凋亡。的变化诱导细胞凋亡。 氧化应激可活化核转录因子氧化应激可活化核转录因子nf-kbnf-kb和和ap-1ap-1，可，可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。亡。( (二二) )钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制： 激活激活caca2+2+/mg/mg2+2+依赖的核酸内切酶，降解依赖的核酸内切酶，降解dnadna链；链； 激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基 转移，在肽链间

38、形成共价键，使细胞骨架蛋白分转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分 子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成； 激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录； caca2+2+在在atpatp的配合下使的配合下使dnadna链舒展，暴露出核小体链舒展，暴露出核小体 之间的连接区内的酶切位点，有利于之间的连接区内的酶切位点，有利于dnadna内切酶切内切酶切 割割dnadna。 bcl-2bcl-2 ( ()()() ) 线粒体线粒体 ptpptp开放开放 apaf+cyt.c caspase-9caspase-9酶

39、原酶原 caspaes-9caspaes-9 m下降下降 caspase-3caspase-3酶原酶原 caspase-3caspase-3 caspase抑制剂抑制剂 aif 蛋白质水解蛋白质水解 无活性核无活性核酸酸内切酶内切酶 细胞凋亡细胞凋亡 核酸核酸内切内切 酶激活酶激活 dna dna断裂断裂ca2+no缺血缺血缺氧缺氧活性氧活性氧（+）( () )（+）（+）（+）( () )（三）线粒体损伤在细胞凋亡中的作用（三）线粒体损伤在细胞凋亡中的作用20022002年年1010月月7 7日英国人悉尼日英国人悉尼布雷诺尔；美国人罗伯特布雷诺尔；美国人罗伯特霍霍维茨和英国人约翰维茨和英国人

40、约翰苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。20022002年诺贝尔生理与医学奖获得者（图片来自年诺贝尔生理与医学奖获得者（图片来自http:/www.nobel.se/http:/www.nobel.se/）细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法基于形态学观察的染色法基于形态学观察的染色法基于基于dna 片断化的检测法片断化的检测法膜联蛋白检测法膜联蛋白检测法caspase酶分析法酶分析法流式细胞仪定量分析法流式细胞仪定量分析法五五. .细胞凋亡常用的研究方法细胞凋亡

41、常用的研究方法（一）细胞凋亡的形态学研究方法（一）细胞凋亡的形态学研究方法1 1、光学显微镜和倒置显微镜、光学显微镜和倒置显微镜（1 1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2 2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。染色质分

42、割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2、 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜常用的常用的dnadna特异性染料有：特异性染料有：ho 33342 (hoechst ho 33342 (hoechst 33342)33342)，ho 33258 (hoechst 33258), dapiho 33258 (hoechst 33258), dapi。三种。三种种染料与种染料与dnadna的结合是非嵌入式的，主要结合在的结合是非嵌入式的，主要结合在dnadna的的a-ta-t碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。3 3、透射电子

43、显微镜观察、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡凋亡期（期（pro-apoptosis nucleipro-apoptosis nuclei）的细胞核内染）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象cavitationscavitations）的空泡结构的空泡结构( (图图2)2)；a a期细胞核的染色质高度凝聚、期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。生凋亡小体。 凋亡细胞超微结构改变（扫描电镜）凋亡细胞

44、超微结构改变（扫描电镜）凋亡细胞超微结构改变（透射电镜）凋亡细胞超微结构改变（透射电镜）核浓缩呈球形核浓缩呈球形染色质边聚染色质边聚呈新月形呈新月形坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡细胞 鉴定细胞凋亡的形态学常用方法鉴定细胞凋亡的形态学常用方法特性特性 推荐使用手段推荐使用手段说明说明细胞表面改变细胞表面改变 胞浆改变胞浆改变 染色质凝聚染色质凝聚核裂解核裂解 超微结构超微结构 扫描电镜扫描电镜 相差显微镜相差显微镜 相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜 流式细胞仪流式细胞仪 透射电镜透射电镜 微绒毛消失，芽状突起。微绒毛消失，芽状突起。 见到凋亡小体见到凋亡小体细胞皱缩，质膜变形，胞细胞皱缩，

45、质膜变形，胞 浆空泡浆空泡适用于组织切片适用于组织切片用结合用结合dna的染料的染料(pi) 标记。适用于培养细胞标记。适用于培养细胞定量测定定量测定dna含量，测含量，测 量细胞的大小和蛋白。量细胞的大小和蛋白。 用于培养细胞用于培养细胞完整的细胞器，胞浆空完整的细胞器，胞浆空 泡，核染色质凝聚核裂泡，核染色质凝聚核裂 解，凋亡小体，适用于解，凋亡小体，适用于 组织切片或培养细胞组织切片或培养细胞（二）（二）dnadna降解分析降解分析1 1、dna ladder:dna ladder:进行进行dnadna的凝胶电泳和溴化乙啶染的凝胶电泳和溴化乙啶染色（琼脂糖凝胶电泳、色（琼脂糖凝胶电泳、s

46、ds-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、dnadna印迹、脉冲场电泳、单细胞电泳技术等）印迹、脉冲场电泳、单细胞电泳技术等）细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞dna电泳图电泳图1细胞色素细胞色素c诱导诱导0 h2细胞色素细胞色素c诱导诱导1 h3细胞色素细胞色素c诱导诱导2 h4细胞色素细胞色素c诱导诱导3 h5细胞色素细胞色素c诱导诱导4 h6阴性对照阴性对照7marker 2 2、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase termina

47、l -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunelmediated nick end labeling, tunel）原理：细胞凋亡中原理：细胞凋亡中, , 染色体染色体dnadna双链断裂或单链断双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性裂而产生大量的粘性3-oh3-oh末端，可在脱氧核糖核苷末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（酸末端转移酶（tdttdt）的作用下，将脱氧核糖核苷酸）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到衍生物标记

48、到dnadna的的3-3-末端，从而可进行凋亡细胞的末端，从而可进行凋亡细胞的检测检测. .3 3、通过、通过fcmfcm进行检测进行检测（三）（三）酶学分析研究方法酶学分析研究方法1 1、caspase3caspase3活性测定活性测定（1 1）western blot western blot 分析分析procaspase-3procaspase-3的活化的活化caspase-3caspase-3正常以酶原（正常以酶原（32kd32kd）的形式存在于胞）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3caspase-3由两个大

49、亚基（由两个大亚基（17kd17kd）和两个小亚基）和两个小亚基（12kd12kd）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。导致细胞凋亡。（2 2）caspase-3caspase-3作用的特异底物作用的特异底物( ( 荧光测定免荧光测定免疫吸附法疫吸附法, fient ) , fient ) 乙酰化天冬氨酸乙酰化天冬氨酸- -谷氨酸谷氨酸- -缬氨酸缬氨酸- -天冬氨酰胺天冬氨酰胺, (ac-, (ac-devd),devd),设计出荧光物质偶联的短肽设计出荧光物质偶联的短肽ac-devd-amcac-devd-amc。在共价偶。在共价偶联时，联时

50、，amcamc不能被激发荧光，短肽被水解后释放出不能被激发荧光，短肽被水解后释放出amcamc，自，自由的由的amcamc才能被激发发射荧光。才能被激发发射荧光。而且而且caspase3caspase3活性的大小与活性的大小与ac-devd-amcac-devd-amc的分解量或自由荧光的分解量或自由荧光amcamc产生的荧光的强弱呈产生的荧光的强弱呈正比。本法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究。而且特异正比。本法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究。而且特异性强，灵敏度高，无交叉反应。只要有性强，灵敏度高，无交叉反应。只要有5%5%的细胞发生凋亡的细胞发生凋亡，用该方法即可检测出来。，用该方法即可检测出来。2 2、多聚（、多聚（adp-adp-核糖）聚合酶核糖）聚合酶polypoly（adp-riboseadp-ribose）polymerasepolymerase，