基因转移与基因治疗

1、 基因转移基因转移与与 基因治疗基因治疗复旦大学复旦大学 遗传学研究所遗传学研究所薛京伦薛京伦20032003，10 10基因：染色体上的基因：染色体上的dna片段，是片段，是遗传信息结构和功能的基本单位。遗传信息结构和功能的基本单位。基因基因 决定决定 生老病死生老病死 控制控制 高矮胖瘦高矮胖瘦 影响影响 喜怒哀乐喜怒哀乐基因组：某一生物的细胞中所带有基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。的全部遗传信息。一、基因治疗概念一、基因治疗概念 基因治疗基因治疗(gene therapy) (gene therapy) 指将正常基因或有治疗作用的基指将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式

2、导入靶细胞因通过一定方式导入靶细胞, ,纠正纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。学高技术。understanding of the disease process structure/function of gene to be introduced efficient delivery of gene control of gene expression prevention/control of immune responsesanimal model and assessment of functi

3、on clinical trial体细胞基因治疗体细胞基因治疗将基因作为一种特殊将基因作为一种特殊“药物药物”，通过，通过体细胞基因转移治疗疾病体细胞基因转移治疗疾病 慢性治疗慢性治疗急性治疗急性治疗预防预防遗传性疾病遗传性疾病获得性疾病获得性疾病功能丧失功能丧失功能获得功能获得二、基因治疗和传统的基因工程的区别二、基因治疗和传统的基因工程的区别二者都着眼于寻找可治病或有其他应二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的用价值的“目的基因目的基因”。 基因工程：基因工程： 目的基因目的基因载体载体导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋白体外表达所需要的蛋

4、白经过分离经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品纯品, 最终是制造出一种蛋白类的药物。最终是制造出一种蛋白类的药物。 基因治疗基因治疗目的基因目的基因载载体体导入人体，目的基因在人体内导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白的细胞中制造所需要的蛋白达到达到治病的目的。治病的目的。 基因治疗在技术上一旦成功基因治疗在技术上一旦成功, 其优其优势：势：制品为基因及其载体，非基因制品为基因及其载体，非基因表达蛋白产物表达蛋白产物,不需复杂的蛋白产物分不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺离和纯化工艺生产成本远远低于基生产成本远远低于基因工程产品因工程产品

5、从理论上讲从理论上讲,凡能治病的凡能治病的基因，都有可能开发成为基因，都有可能开发成为“药物药物” 半衰期半衰期 但基因治疗难度高，技术要求极为但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。体后，必须能够控制它的表达。 因此，基因治疗是生物高技

6、术的高因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。技术的高度综合。gene replacementgene augmentation therapy (gat)gene correction (chimeraplasty)targeted killing of specific cellstargeted inhibition of gene expression (gene ablation)gene correction - chimeraplastyt

7、umour celltkthymidine kinasegeneviral vectorganciclovirganciclovir phosphatetargeted killing genetic pro-drug activation therapyall gene therapy strategies dependon getting the gene or genetic material into the target cells! 四、基因转移的主要方法：四、基因转移的主要方法： ：dna transfer 转移：转移：基因导入或转移广义的概念。基因导入或转移广义的概念。tran

8、sduction 转导：转导：噬菌体介导的细菌之间的基噬菌体介导的细菌之间的基 因因 转移。转移。transformation 转化：转化：将裸将裸dna或质粒导入原核或质粒导入原核 和真核细胞。和真核细胞。:ex-vivoin-vivotopical deliveryin-vivosystemic deliveryvexamples:- bone marrow- liver cells- skin cellsexamples:- brain- muscle- eye- joints- tumorsexamples:- intravenous- intra-arterial- intra-pe

9、ritoneal1、病毒载体类型、病毒载体类型反转录病毒（反转录病毒（rv）载体）载体腺病毒（腺病毒（av）载体）载体腺相关病毒（腺相关病毒（aav）载体）载体单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（hsv）载体）载体慢病毒（慢病毒（lentivirus)载体等载体等载体特征载体特征： reproducibility stable propagated purified to high titers mediated targeted deliveryadvantage and disadvantage of gene-transfer vector(1)基因治疗病毒载体比较基因治疗病毒载体比较 rv a

10、v aav hsv lvrv av aav hsv lv基因组成基因组成 ssrna dsdna ssdna dsdna dsrnassrna dsdna ssdna dsdna dsrna基因组长度基因组长度 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb10kb 36kb 5kb 152kb 10kb装载容量装载容量 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb30 kb capacity generation iiiadeno can be grown at very high titers, however do not integrate can contain rcas are

11、toxic /immunogenicexamplesotc deficiency (clin, -)cystic fibrosis (clin, - )oncolytic viruses (clin, +)腺病毒载体研究进展与展望腺病毒载体研究进展与展望 进展进展 展望展望ad载体用于治疗性的载体用于治疗性的angiogenesis 降低毒性的方法将继续获得进展降低毒性的方法将继续获得进展,取得进展取得进展 最终将提供安全的最终将提供安全的ad载体系统载体系统.ad引起的毒性问题得到进一步认识引起的毒性问题得到进一步认识 靶向方法的应用将进一步改进靶向方法的应用将进一步改进.提高提高ad载体的

12、靶向性，改善疗效载体的靶向性，改善疗效 缺陷型的缺陷型的ad载体生产将不断进展载体生产将不断进展.新一代新一代ad载体能降低毒性，改善表达载体能降低毒性，改善表达 将面临再次注射的挑战将面临再次注射的挑战2 2 ，pa317pa317，cripcrip） 缺陷型的反转录病毒颗粒的缺陷型的反转录病毒颗粒的rna进入靶细胞后，变成前病毒并整合到进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达外宿主细胞的染色体上，可稳定表达外源基因。源基因。 反转录病毒只能感染处于增殖期反转录病毒只能感染处于增殖期的细胞。的细胞。approachesmurine retrovirusesvsv-pse

13、udotyped rvlentiviruses self-inactivating rvcombination virusesadvantages / limitations9 kb capacity + integration throughtransposition also in quiescent cells(hiv), permit in principle long-termtreatments, however disturbed by:insertional mutagenesisgene silencinghigh mutation ratelow titer of prod

14、uctionexamplesscid (il2r defect, paris) (clin, +)adenosine deaminase deficiency (clin, +!)parkinson (preclin, +)anti cancer (clin +/-)aav） 载体：载体：4.7kb单链单链dna，结构为结构为 itr-rep-cap-itr ，病毒基因组简单，病毒基因组简单，易于消除，可降低细胞毒性和易于消除，可降低细胞毒性和t-淋巴细胞反淋巴细胞反应的危险性；病毒应的危险性；病毒dna可在人可在人19号染色体上号染色体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出现才进行位点特异性整

15、合，需要辅助因子出现才复制；其复制；其rep蛋白可能介导这种定向整合宿蛋白可能介导这种定向整合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半年以上。年以上。 但但aav载体接纳的外源载体接纳的外源dna小于小于4.5kb，载体整合效率较低，制备困难载体整合效率较低，制备困难approacheshelper-dependent productionhelper independent productioncis-complementing vectorsco-infectionadvant

16、ages / limitationspersistence in the genome permits long-term expression, high titers are easily obtained, immunogenicity is very low,howeversmall capacity (4.5 kb) which does not allow to accommodate large genes or gene clusters.exampleshemophilia b (clin, animal, +)gaucher (clin, animal, +)brain i

17、schemia (animal, +)cystic fibrosis (animal, +/-)lentivirus（慢病毒载体）（慢病毒载体）优点优点: 感染非分裂细胞感染非分裂细胞 ，有，有rv优势优势结构结构: ltr- gag- pol - env-ltr tar tat, rev, tev应用应用: 宿主广泛宿主广泛; 艾滋病基因治疗艾滋病基因治疗问题问题: 安全性安全性adenovirus- no persistence- limited packaging-toxicity, -immunogenicityretrovirus (incl. hiv)- limited packa

18、ging- random insertion- unstable genomegeneral- antibody response- limited packaging- gene silencingsolutions:- synthetic viruses (“virosomes”)biolistic bombardmentor local direct injection - limited areaelectroporation- limited organ accessliposomes, gene correction & co.- very inefficient transfer

19、general- low transfer efficiency- no or little genomic integrationsolutions:- improved liposomes with viral properties (“virosomes”)mw 50- 500 daltonssynthetically preparedrapid diffusion/actionoral delivery possiblecellular delivery: - act at cell surface - permeate cell membrane - imported through

20、 channelscan be delivered as soluble moleculesngstrom/nm sizerapidly reversible treatmentmw 20,000- 100,000 dabiologically preparedslower diffusion/actionoral delivery not possiblecellular delivery - act extracellularlycan be delivered as soluble moleculesnm sizerapidly reversible treatmentprotein d

21、rugnucleic acidmw n x 1,000,000 dabiologically preparedslow diffusionoral delivery inconceivablecellular delivery: - no membrane translocation - no nuclear translocation - no biological importmust be delivered as complex carrier particles50-200 nm sizeslowly or not reversibletherapy with nucleic aci

22、dsrequires particulated formulationis much more complex than previous drug deliverieshas a different degree of reversibility (dosage problem)2 2、非病毒及物理方法、非病毒及物理方法脂质体介导法脂质体介导法磷酸钙转染法磷酸钙转染法机械法（显微注射、基因枪等）机械法（显微注射、基因枪等）deae-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转染法转染法电穿孔法电穿孔法超声波辅助法超声波辅助法纳米材料等纳米材料等中性脂质体中性脂质体 由脂类形成的可高效包装由脂类形成的

23、可高效包装dna的人造的人造单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入细胞，操作简单细胞，操作简单 ，转染效率可高达，转染效率可高达50%，可用于体内试验，但目的基因表达不稳定可用于体内试验，但目的基因表达不稳定阳离子脂质体：阳离子脂质体：阳离子脂质体在水中可阳离子脂质体在水中可形成大小约形成大小约100-400nm单层脂质体。其单层脂质体。其带正电，带负电的带正电，带负电的dna可自动结合到带可自动结合到带正电的脂质体正电的脂质体上，形成上，形成dna-dna-阳离子脂质阳离子脂质体复合

24、物，与细胞膜作用使体复合物，与细胞膜作用使dna进入细进入细胞。在该系统胞。在该系统体内基因导入效率低，且体内基因导入效率低，且无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。射外，其前景仍存在问题。 磷酸钙转染法：磷酸钙转染法：将氯化钙、目的将氯化钙、目的dna和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有dna的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷酸钙酸钙-dna复合物粘附到细胞膜，通过复合物粘附到细胞膜，通过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过程简单有效程简单有效 ，适用于贴壁、非贴壁

25、细，适用于贴壁、非贴壁细胞，转染效率可达胞，转染效率可达20%左右，但目的左右，但目的基因表达不稳定基因表达不稳定基因枪工作原理基因枪工作原理显微注显微注射射approachesantisenseribozymes/dnazymestriple helixdecoy / competitorsgene-correcting oligosadvantages / limitationsthese procedures may be suitable for :handling dominant defectstransient treatments (gene modulation)perman

26、ent treatments (gene correction)examplesanti cancer (clin,preclin., +/-)restenosis (clin, +)muscular distrophy (animal, +)电穿孔法电穿孔法通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导目的中转导目的dna。细胞悬浮液置于电场。细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更

27、高）的毒性。或更高）的毒性。deae-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转染法转染法 带正电的带正电的deae-葡聚糖或葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的外源多聚体复合物和带负电的外源dna分子分子作用，使得作用，使得dna可以结合在细胞表面。可以结合在细胞表面。通过使用通过使用dmso或甘油获得的渗透休克或甘油获得的渗透休克将外源将外源dna导入。两种试剂都已成功用导入。两种试剂都已成功用于转染。于转染。deae-葡聚糖仅限于瞬时转染。葡聚糖仅限于瞬时转染。approachesnaked dna injection /biolisticnaked dna + pressuren

28、aked dna + electroporationliposomal formulationscombinationsadvantages / limitationsunlimited size capacity + lowerimmunogenicity and lower bio-riskof non viral formulations isdisturbed bylow efficiency of gene transfereven lower stable integrationexamplescritical limb ischemia (clin, +)cardiac isch

29、emia (clin, +/-)vaccination (clin, +/-)anti restenosis (preclin. +/-)stabilityparticle should resist serum inactivationparticle should be inert to immune inactivationaddressabilityparticle should possess a vascular addressing signatureparticle should bear a tissue-docking specificitydna construct sh

30、ould include tissue-specific regulatory elementsefficiencycargo should be protected from cytoplasmic inactivation (ex. lysosomes)cargo should contain nuclear-translocating signalsdna cargo should include genome-integration functionsdna element must be guaranteed to function after genomic integration

31、 (no silencing)other propertiesparticle should not include immunogenic/toxic surfacescargo should not encode immunogenic/toxic productscargo should include anti-apoptotic functionsseveral independent problems must be solved for a nonviral formulation to be suitable for clinical treatment and for ind

32、ustrial productionmost viral vectors include many, if not all those properties裸裸dna基因转移和治疗基因转移和治疗 进展进展展望展望裸裸dna肌肉注射，活体转移肌肉注射，活体转移非病毒基因转移越来越重要非病毒基因转移越来越重要电击促进质粒电击促进质粒dna进入肌肉皮肤进入肌肉皮肤未来几年遗传病临床试验将首选血友病未来几年遗传病临床试验将首选血友病血管内导入质粒血管内导入质粒dna，肝细胞基因转移，肝细胞基因转移duchenne 肌营养不良，关节炎等肌营养不良，关节炎等尾静脉导入尾静脉导入pdna，简单有效，转染大、

33、，简单有效，转染大、 啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表小鼠肝细胞小鼠肝细胞 达状况和基因治疗方法广泛应用达状况和基因治疗方法广泛应用pdna表达载体可高水平持续表达表达载体可高水平持续表达血管内裸血管内裸dna导入为细胞有效涉入导入为细胞有效涉入pdnarnai将在基因治疗领域中成为重要手将在基因治疗领域中成为重要手裸裸dna导入法已经在临床研究（导入法已经在临床研究（paod， 段段外周动脉闭锁症）外周动脉闭锁症）sirna可通过血管内基因转移法有效导入可通过血管内基因转移法有效导入knockout 小鼠小鼠 problems that must be sol

34、ved to be suitable for clinical treatment and for industrial production are different between viral and non-viral vectorswhen ignoring their low efficiency, nonviral vectors appears largely superiormost relevant issues in the two main vectorology sectors (viral versus nonviral)viral vectorspackaging

35、 capacity from 4 to 30 kb problem for some large genes (ex. dystrophin gene or cftr gene)important toxic load: ratio infectious/non-infectious particles from 1/10 to 1/100strong immunogenicity: capsid and envelope proteins, residual viral genescontaminants: replication-competent viruses (ex. wild ty

36、pe revertant viruses)viral amount (titre) obtainable with recombinants (ex. 10exp5 = poor, 10exp10=excellent)complexity of production (existence or not of packaging cell systems)emotional problems linked to pathogenicity of donor vectors (ex. lentiviruses)nonviral vectorspackaging capacity not an is

37、sue, even very large constructs can be used (example entire loci up to 150 kb)minor toxic load: small percentage of non relevant adventitious materialsmoderate immunogenicity: methylation status of dna (example cpg motifs)contaminants: adventitious pathogens from poor dna purification (ex endotoxins

38、)amount of dna molecules is usually not a problem, the other components depends on chemical synthesisno particular complexity, except for specially formulated liposomes no particular emotional problems linked to the nature of the reagentsrandom integrating vectorslr-lentiviruseslr-retroviruseslr-aavlplasmids (low frequency)lplasmids + transposase (eg sleeping beauty)transient, non integrating vectorsladenoviruslplasmidlrna v