微生物生长和环境

1、2021/2/2112021/2/212一、获得纯培养的方法一、获得纯培养的方法2021/2/213一、获得纯培养的方法一、获得纯培养的方法1、稀释平皿分离法、稀释平皿分离法由一个或少数几由一个或少数几个细菌在固体培个细菌在固体培养基上形成的肉养基上形成的肉眼可见的集落眼可见的集落菌落菌落涂布平皿法涂布平皿法倾注平皿法倾注平皿法2021/2/2162、平皿划线分离法、平皿划线分离法分区划线法分区划线法连续划线法连续划线法2021/2/217划线分离划线分离3、选择性培养基的利用、选择性培养基的利用n不同菌对营养的要求不同菌对营养的要求 分离真菌分离真菌, ,用马丁氏培养基用马丁氏培养基,pH,

2、pH偏酸偏酸 分离放线菌分离放线菌, ,用高氏用高氏1 1号号, ,pHpH中性偏碱中性偏碱n不同菌对化学试剂的敏感性不同菌对化学试剂的敏感性 分离放线菌分离放线菌, ,培养基中加培养基中加10%10%酚酚, ,抑制细菌、真菌抑制细菌、真菌 从土壤中分离真菌从土壤中分离真菌, ,加孟加拉红加孟加拉红, ,抑制细菌生长抑制细菌生长n根据分离对象的代谢特征根据分离对象的代谢特征: : 分离能发酵纤维素的菌株分离能发酵纤维素的菌株, ,培养基以纤维素为唯一碳源培养基以纤维素为唯一碳源; ;分分离固氮菌离固氮菌, ,用无氮培养基用无氮培养基根据所要分离的菌种特性选用培养基根据所要分离的菌种特性选用培养

3、基,如如:4、富集培养、富集培养对自然界中很少的或难以获得的微生物用富集培养对自然界中很少的或难以获得的微生物用富集培养基使其在数量上占优势基使其在数量上占优势,再做平板分离获得纯培养再做平板分离获得纯培养2021/2/219二、细菌群体生长的测定二、细菌群体生长的测定 细菌的生长和繁殖难以分开细菌的生长和繁殖难以分开,因此因此,常常以群体生长作为细菌生长的指标以群体生长作为细菌生长的指标 细菌群体生长测定一般采用细菌群体生长测定一般采用细胞数细胞数量量和和生物量生物量两种方法两种方法2021/2/2110（一）细胞数量的测定（一）细胞数量的测定n细胞总数的测定（包括活的和已丧失活细胞总数的测

4、定（包括活的和已丧失活力的细菌）力的细菌） 1、显微直接计数法显微直接计数法 2、比浊法比浊法 3、染色涂片计数法染色涂片计数法 2021/2/2111 1、显微直接计数法显微直接计数法2021/2/21122、比浊法比浊法 比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多, ,浊度越大浊度越大, ,在光电比色计中测定时所吸收的光线越多在光电比色计中测定时所吸收的光线越多3、染色涂片计数法染色涂片计数法 取取0.01ml的菌悬液放在的菌悬液放在1cm2 的玻片上的玻片上,让其干燥让其干燥,然后固定染色然后固定染色,再置显微镜下计数每一视野中的菌数再置显微镜下

5、计数每一视野中的菌数,算算出视野面积出视野面积,按下列公式即可求出每按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌原菌液中的含菌数。数。 每每ml原菌液中的含菌数原菌液中的含菌数=视野中的平均菌数视野中的平均菌数1cm2/视野面积视野面积100稀释倍数稀释倍数 2021/2/2113n活菌数量的测定活菌数量的测定 1、稀释平板测数法、稀释平板测数法 2、最大概率法（、最大概率法（MPN法）法） 3、浓缩法、浓缩法1、稀释平板测数法、稀释平板测数法2021/2/21152、最大概率法、最大概率法方法是方法是: :将待测菌液于液体中作十倍系列稀释将待测菌液于液体中作十倍系列稀释, ,每稀释度做每稀释度做3

6、535个重复个重复, ,经培养后经培养后, ,检查细菌的生长检查细菌的生长, ,以有细菌生长的最后三以有细菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标个稀释度的管数作数量指标, ,由数理统计表查出近似值由数理统计表查出近似值, ,再乘以再乘以数量指标第一位的稀释倍数数量指标第一位的稀释倍数, ,即为原菌液中的菌数。即为原菌液中的菌数。例如例如: :某细菌在稀释培养法中生长情况如下某细菌在稀释培养法中生长情况如下: :稀释度稀释度: : 101033, ,101044, ,101055, ,101066, ,101077, ,101088重复数重复数: : 5 5 5 5 5 55 5 5 5 5 5

7、有菌生长管数有菌生长管数: : 5 5 5 4 1 05 5 5 4 1 0根据上述结果根据上述结果, ,数量指标为数量指标为“541”541”, ,查表得近似值为查表得近似值为1717, ,乘以乘以第一位数的稀释倍数第一位数的稀释倍数, ,得出原始培养物的活菌数得出原始培养物的活菌数=17=1710105 5个个3、薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法 此法用于计数空气中的含菌数此法用于计数空气中的含菌数 2021/2/2116n测定细胞干重法测定细胞干重法 单位体积培养物中细胞物质的干重单位体积培养物中细胞物质的干重 n含氮量测定法含氮量测定法 微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的微生物细胞中蛋白

8、质的含量是比较稳定的,测出微生测出微生物细胞中的含物细胞中的含N量后再换算出蛋白质的含量量后再换算出蛋白质的含量,可用凯可用凯氏定氏定N N法法 。 蛋白质的含量蛋白质的含量=氮量氮量6.256.25nDNA含量的测定含量的测定nATP含量的测定含量的测定n代谢活性法代谢活性法（二）细胞生物量的测定（二）细胞生物量的测定2021/2/2117 批量培养是实验室常采用的方法批量培养是实验室常采用的方法,即细菌即细菌在一定体积的培养基中生长在一定体积的培养基中生长,经历了消长的生活经历了消长的生活周期周期 以少量的纯培养细菌接种有限的液体培养以少量的纯培养细菌接种有限的液体培养基基,并在培养过程中

9、定时取样测数并在培养过程中定时取样测数,可以发现细菌可以发现细菌群体的生长有一定的规律。若以时间为横坐标群体的生长有一定的规律。若以时间为横坐标,以活菌数的对数为纵坐标以活菌数的对数为纵坐标,可以绘出一条类似于可以绘出一条类似于S形的曲线形的曲线,该曲线称为细菌纯培养的生长曲线该曲线称为细菌纯培养的生长曲线菌数的对数延缓期对数期稳定期衰亡期Growth Cycle of Populations2021/2/21202021/2/21212021/2/2122n细菌在对数期每分裂一次所需要的时间称为世代时间,简称代时,用G表示nNt = N02n （ Nt = 对数期t时细菌数 ;N0 = 对数

10、期开始细胞数;n = 繁殖世代数.）n n = ( log Nt log N0 ) /log 2 = 3.3 (log Nt log N0) n G = t/n = t/3.3 (log Nt log N0) = 0.301 t/ (log Nt log N0) 2021/2/2123在衰亡期在衰亡期, ,有的细胞开始自溶有的细胞开始自溶, ,产生或释放出一些产物产生或释放出一些产物, ,如如aaaa、抗生素、转化酶、短肽酶等。菌体形状呈多形态、抗生素、转化酶、短肽酶等。菌体形状呈多形态, ,大大小不一小不一, ,甚至畸形甚至畸形, ,细胞质内多液泡细胞质内多液泡, ,有些有些G G+ +变为

11、变为G G。2021/2/2124n丝状真菌在固体培养基上的生长丝状真菌在固体培养基上的生长 常以菌丝长度、菌落直径或面积来表示n真菌在液体培养基中的生长真菌在液体培养基中的生长 以时间为横坐标,菌体干重为纵坐标,可绘出与细菌相似的曲线,区分为三个不同的生长阶段:延滞期、迅速生长期和衰退期2021/2/21252021/2/2126酵母菌的繁殖方式多种多样酵母菌的繁殖方式多种多样,主要的方式归结为主要的方式归结为:无性繁殖无性繁殖裂殖裂殖（fission）:少数酵母菌的繁殖方式芽殖芽殖（budding）:多数酵母菌的繁殖方式有性繁殖有性繁殖:产生无性孢子产生无性孢子:掷孢子（掷孢酵母属）,节孢

12、子（地）, 厚垣孢子（白假丝酵母）形成子囊孢子形成子囊孢子（ascospore）:酿酒酵母2021/2/2127n在培养基中存在两种能为微生物利用的主要营养物时在培养基中存在两种能为微生物利用的主要营养物时,微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长,进进入稳定期后经过短暂的适应后将利用第二种营养物再入稳定期后经过短暂的适应后将利用第二种营养物再次开始新的对数生长并进入新的稳定期次开始新的对数生长并进入新的稳定期,表现为二阶式表现为二阶式的双峰生长曲线的双峰生长曲线n采用物理或化学的方法使培养微生物的生长处于相同采用物理或化学的方法使培养微生物的生

13、长处于相同的生长阶段并保持同时分裂的生长方式称为同步生长的生长阶段并保持同时分裂的生长方式称为同步生长2021/2/2128用同步培养法获得的培养物叫同步培养物。同步培养法有如下几种: 利用代谢抑制剂控制利用代谢抑制剂控制DNA合成合成 Ecoli胸腺嘧啶缺陷型菌株胸腺嘧啶缺陷型菌株,停止胸腺停止胸腺 嘧啶供给嘧啶供给,DNA不合成不合成,但蛋白质合成但蛋白质合成, 30分钟后加入胸腺嘧啶分钟后加入胸腺嘧啶,DNA合成恢复合成恢复, 细胞分裂。细胞分裂。选择法选择法诱导法诱导法离心沉降法离心沉降法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维薄膜法硝酸纤维薄膜法将不同大小细胞分开培养将不同大小细胞分开培养温度调

14、整法温度调整法 沙门氏菌沙门氏菌25只合成细只合成细胞胞物质物质,37细胞进行分裂细胞进行分裂2021/2/2129n在一个恒定容积的流动系统中在一个恒定容积的流动系统中,一方面以一定的速度一方面以一定的速度不断地加入新的培养基不断地加入新的培养基,另一方面以相同的速度流出另一方面以相同的速度流出培养物培养物,这样可以使容器中微生物的数量和营养状态这样可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定保持恒定,使微生物长期处于旺盛生长阶段使微生物长期处于旺盛生长阶段n连续培养的方法有两类连续培养的方法有两类: 恒浊恒浊连续培养连续培养 恒化恒化连续培养连续培养2021/2/2130 稀释率由流速和培养

15、器容量决定稀释率由流速和培养器容量决定,因此因此,用用1000ml 的容器的容器,流速控制流速控制在在500ml/hr ,稀释率则为稀释率则为0.5hr-1 稀释度过高时稀释度过高时,由于培养物被冲走由于培养物被冲走,生长不能维持在平衡态生长不能维持在平衡态恒化培养中稀释率、与细胞浓度限制性养料的关系恒化培养中稀释率、与细胞浓度限制性养料的关系.2021/2/2133 微生物的生活条件是环境因素的综合微生物的生活条件是环境因素的综合,只有只有各种因素配合适当时各种因素配合适当时,微生物才能旺盛的生长发微生物才能旺盛的生长发育育,影响微生物生长的因子有影响微生物生长的因子有:2021/2/213

16、42021/2/21352021/2/21362021/2/21372021/2/21382021/2/2139湿热灭菌的工艺指标比干热灭菌的工艺指标低是因为湿热灭菌的工艺指标比干热灭菌的工艺指标低是因为: :蒸汽穿透力强蒸汽穿透力强, ,蛋白质有水时变性温度低蛋白质有水时变性温度低, ,蒸汽有潜热蒸汽有潜热 2021/2/2140n微生物的微生物的致死温度致死温度:在一定时间内（如在一定时间内（如10分钟）杀死微分钟）杀死微生物所需要的最低温度称为微生物的致死温度生物所需要的最低温度称为微生物的致死温度n微生物的微生物的致死时间致死时间:在一定温度下在一定温度下,杀死微生物所需要的杀死微生物

17、所需要的时间时间;温度越高温度越高,致死时间越短致死时间越短nD值值:在特定温度下使微生物菌数减少在特定温度下使微生物菌数减少10倍所需的时间倍所需的时间n灭菌灭菌:杀死所有微生物的方法杀死所有微生物的方法,包括细菌的芽胞包括细菌的芽胞n消毒消毒:杀死微生物的营养体杀死微生物的营养体,而不能杀死芽胞的方法而不能杀死芽胞的方法n防腐防腐:抑制微生物的生长抑制微生物的生长,但并不杀死微生物的方法但并不杀死微生物的方法n化疗化疗:杀死寄主内的病原菌的方法杀死寄主内的病原菌的方法2021/2/21412021/2/2142二、水份和渗透压二、水份和渗透压1、水份与干燥、水份与干燥 水是微生物生活的必要

18、条件水是微生物生活的必要条件,微生物生长所需要的微生物生长所需要的水份用水活度来表示水份用水活度来表示,即在一定的温度和压力条件下即在一定的温度和压力条件下,溶溶液中的蒸汽压与纯水蒸汽压之比液中的蒸汽压与纯水蒸汽压之比aw = P solution / P water 微生物生长的最低微生物生长的最低aw值值:细菌细菌aw 酵母酵母 霉菌霉菌 耐盐细菌和耐旱真菌耐盐细菌和耐旱真菌大部分的细菌大部分的细菌,藻类和一些真菌藻类和一些真菌,如毛霉如毛霉,根霉根霉,担子菌类为担子菌类为0.90.99嗜盐细菌、曲霉嗜盐细菌、曲霉 为为0.76地衣和丝状真菌及一些酵母种类为地衣和丝状真菌及一些酵母种类为0

19、.60微生物生长的微生物生长的aw值在值在0.660.99之间之间2021/2/21432021/2/21442021/2/2145 pH值影响微生物生长的主要作用在于值影响微生物生长的主要作用在于: 引起细胞膜电荷的变化引起细胞膜电荷的变化,从而影响了微生物对从而影响了微生物对营养物质的吸收。营养物质的吸收。 影响代谢过程中酶的活性。影响代谢过程中酶的活性。 改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。质的毒性。 另一方面另一方面, ,微生物代谢活动常改变氢离子浓度微生物代谢活动常改变氢离子浓度 如如: :乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸乳酸菌分解葡萄糖

20、产生乳酸, ,pH值下降值下降, ,基质基质被酸化。尿素细菌分解尿素产氨使被酸化。尿素细菌分解尿素产氨使pH上升。上升。 为了防止基质中的为了防止基质中的pH值发生过大的变化影响微值发生过大的变化影响微生物生长生物生长, ,在配制培养基时通常加入缓冲剂在配制培养基时通常加入缓冲剂2021/2/2146 黑曲霉在黑曲霉在pH 23的环境中发酵蔗糖以产柠檬酸为主的环境中发酵蔗糖以产柠檬酸为主,产草酸极少。产草酸极少。 在在pH近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸,柠檬酸产量很低柠檬酸产量很低 酵母菌在酵母菌在pH4.55.0生长进行乙醇发酵生长进行乙醇发酵,不产甘油和醋酸不

21、产甘油和醋酸 在在pH8时生长发酵产物除乙醇外时生长发酵产物除乙醇外,还有甘油和醋酸。还有甘油和醋酸。 在生产实践中还可利用在生产实践中还可利用pH值防止杂菌生长。值防止杂菌生长。 如生产面包时加丙酸钙作防腐剂如生产面包时加丙酸钙作防腐剂,抑制细菌生长抑制细菌生长 微生物生长繁殖的最适微生物生长繁殖的最适pH与其合成某种代谢产物的与其合成某种代谢产物的pH通常是不一样的。通常是不一样的。例如例如:丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适pH是是5.57.0 丙酮丙酮 丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适pH是是4.35.3微生物在不同的微生物在不同的pH下积累的代谢产物

22、不一样下积累的代谢产物不一样,如如:2021/2/2147 氧气与微生物的生长氧气与微生物的生长根据微生物与氧的关系根据微生物与氧的关系,将微生物分成四类将微生物分成四类:2021/2/21482021/2/2149五、光、辐射和超声波五、光、辐射和超声波2021/2/2150UV的杀菌作用主要是由于的杀菌作用主要是由于UV引起核酸形成胸腺嘧啶引起核酸形成胸腺嘧啶二聚体二聚体,从而干扰了核酸的复制从而干扰了核酸的复制,另外另外UV使使O2O3（臭氧）（臭氧）,O3放出氧化能力强的新生态氧放出氧化能力强的新生态氧O,O也有也有杀菌作用杀菌作用X射线波长为射线波长为0.0613.6nm射线波长为射

23、线波长为0.010.14nm均为高能电磁波均为高能电磁波,对微生物有显对微生物有显著的杀菌作用著的杀菌作用,常用作罐头灭菌常用作罐头灭菌超声波频率在超声波频率在2万赫兹以上万赫兹以上,其作用是使细胞破裂其作用是使细胞破裂,引引起起M死亡死亡超声波超声波紫外线紫外线2021/2/2151六、化学杀菌剂和抑菌剂六、化学杀菌剂和抑菌剂 重金属离子带正电荷,易与带负电荷的菌体蛋白质结合,使蛋白质变性,有较强的杀菌作用升汞（HgCl2）:0.050.1%用于非金属器皿的消毒红汞:2%水溶液用于皮肤,粘膜及小伤口的消毒硫柳汞:0.01-0.1%用于皮肤及手术部位的消毒,生物制品防腐。铜盐:波多液含CuSO

24、4用来杀真菌,防治植物病害 1. 重金属盐重金属盐:2021/2/2152高锰酸钾高锰酸钾,H2O2,过氧乙酸等能使菌体酶蛋白中的过氧乙酸等能使菌体酶蛋白中的SH氧氧化成化成SS,使酶失活使酶失活高锰酸钾高锰酸钾:0.1%用于皮肤用于皮肤,尿道及蔬菜尿道及蔬菜,水果消毒。水果消毒。H2O2 : 13%用于表面消毒如伤口消毒。用于表面消毒如伤口消毒。过氧乙酸过氧乙酸: 0.20.5%用于皮肤、塑料、玻璃、人造纤用于皮肤、塑料、玻璃、人造纤维消毒维消毒 2RSH+2X RSSR+2XH2、氧化剂、氧化剂:2021/2/21533. 卤素化合物卤素化合物: 以以Cl,I为常用为常用,例如用作饮水消毒

25、的漂白粉为次亚氯酸盐例如用作饮水消毒的漂白粉为次亚氯酸盐,主要成份是主要成份是CaCl2Ca (OH)2 及及Ca(Ocl)2,次亚氯酸盐分解放出次亚氯酸盐分解放出新生态氧新生态氧,具有强烈的氧化作用而杀菌具有强烈的氧化作用而杀菌n 漂白粉漂白粉: 1020%用于地面和厕所消毒用于地面和厕所消毒n 0.51%的上清液用于空气及物体表面消毒的上清液用于空气及物体表面消毒,亦可亦可作饮作饮 水消毒剂水消毒剂nCl2:0.20.5ppm可作饮水及游泳池水消毒剂可作饮水及游泳池水消毒剂nI2: 2.5%的碘酒用于皮肤消毒的碘酒用于皮肤消毒2021/2/21544. 表面活性剂表面活性剂: 具有降低表面张力效应的物质叫做表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫做表面活性剂,如如新洁尔灭新洁尔灭,在较低浓度有抑菌作用在较低浓度有抑菌作用,在较高浓度有杀菌在较高浓度有杀菌作用。作用。 新洁尔灭新洁尔灭: : 0.050.1%用于皮肤用于皮肤, ,粘膜及外科手粘膜及外科手术器械浸泡消毒术器械浸泡消毒 2021/2/21555. 有机化合物有机化合物: 酚、醇、醛是常用的杀菌剂酚、醇、醛是常用的杀菌剂,它们能损伤细胞膜和壁它们能损伤细胞膜和壁,抑制某些抑制某些酶系统酶系统,（如脱（如脱H酶和氧化酶）酶和氧化酶）,并能使蛋白质变性并能使蛋白质变性 酚（石炭酸）酚（石炭酸）