光合作用基因工程

1、第十二章第十二章 叶绿体基因工程叶绿体基因工程 光合作用光合作用 绿色植物或光合细菌借助光的作用将大气中co2转化成动植物及人类赖以生存的碳水化合物，同时向周围环境释放o2的过程，也即光合细胞捕获光能并将其转化为化学能的过程，称为光合作用。co2 + h2o光光叶绿体叶绿体（ch2o）+ o2可用一个简单的方程式表示：光合作用是一个极为错综复杂的过程。从宏观角度看，它牵涉到细胞、个体乃至群体及外界环境等方方面面；从微观角度看，它是核基因组、叶绿体基因组及多种细胞结构协同作用的结果。正因为如此，通过光合作用基因工程来提高光合效率并非一朝一夕之事。首要问题之一便是解决与之密切相关的叶绿体基因工程的

2、各种理论性和技术性问题。 光合作用的研究历史实验一：实验一：1771年，英国科学家普利斯特利把一支点燃的蜡烛和一只小白鼠分 别放到密闭的玻璃罩里，蜡烛不久就熄灭 了，小白鼠很快也死去了。 他把两盆植物分别放 到两个密闭的玻璃罩里。他发现植物能够长 时间地活着，蜡烛没有熄灭，小鼠活动正常。 植物可以在光下净化“坏了”的空气光合作用 1782年，瑞士人有化学分析的方法弄清了光合的反应物是co2和h2o，产物是糖和o2。但认为糖是co2的简单聚合：实验二：实验二：实验三：实验三： 1905年，blackman研究光合效率与光强和温度的关系时，对光合过程是否一直需要光产生了疑问。也使人们对co2的同化

3、方式有了全新的认识。n(co2)cccc1低光时，温度再高光合低光时，温度再高光合效率也不增加。说明光是效率也不增加。说明光是必须的。必须的。2强光下，温度升高，光强光下，温度升高，光合加快，说明在高光强下，合加快，说明在高光强下，温度是光合的限制因素，温度是光合的限制因素，也说明光合作用涉及酶促也说明光合作用涉及酶促反应（暗反应）；反应（暗反应）；3温度相同时，随光照增温度相同时，随光照增强，光合加快，特别是在强，光合加快，特别是在低温时，光照增强，光合低温时，光照增强，光合加快，说明光合作用中存加快，说明光合作用中存在与温度无关的反应，也在与温度无关的反应，也就是非酶促反应。（光反就是非酶

4、促反应。（光反应）应）实验四：实验四：温温 度度光合效光合效率率低光低光强光强光光合有两个反应阶段：光反应和暗反应光能吸收co2同化 1937年，希尔用体外的叶绿体和水反应得到了o2，为光反应的研究打开了大门。实验五：实验五：4fe33+2h2o4fe22+4h+o2光叶绿体说明叶绿体在光下可分解h2o，产生电子，产生还原能力，使物质还原，即光反应可产生电子将物质还原。 1951年，发现体内物质nadp可被光合作用还原为nadph。实验六：实验六：nadp+h2onadph+h+1/2o2光叶绿体 这是一个振奋人心的消息，因为科学家们早已知这是一个振奋人心的消息，因为科学家们早已知道，道，na

5、dph是生物体内的重要的还原剂。是生物体内的重要的还原剂。 1954年，发现adp在光合作用下可形成atp。实验七：实验七：adp+piatp光叶绿体 在光下叶绿体合成的在光下叶绿体合成的nadph和和atp，是用来同化是用来同化co2的。的。在植物细胞中,两种细胞器有自己的遗传物质dna,分别为叶绿体和线粒体,这两个细胞器都是植物中用来进行能量转换的细胞器。叶绿体大小和人红细胞大小相似,因此也是植物细胞器中的“巨人”。为了了解其奥妙所在，首先必须对叶绿体结构及功能有一个大致的认识。 高等植物叶绿体多呈扁平椭球形，主要分布在叶片的高等植物叶绿体多呈扁平椭球形，主要分布在叶片的栅栏组织和海绵组织

6、中。栅栏组织和海绵组织中。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径510um，短径24um，厚23um。高等植物的叶肉细胞一般含50200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。在藻类中叶绿体形状多样，有网状、带状、裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um。叶绿体由叶绿体外被（chloroplast envelope）、类囊体（thylakoid）和基质（stroma）3部分组成，叶绿体含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。一、形态与结构一、形态与结构叶绿体的形态与分布叶绿体的形态与分布叶绿体被膜

7、由两层单位膜组成，两膜间距510nm。被膜上无叶绿素，它的主要功能是控制物质的进出，维持光合作用的微环境。外膜(outer membrane)为非选择性膜，外层膜含有少量孔蛋白(porin),这些孔蛋白具有较大的通道, 分子量小于10000的物质如蔗糖、核酸、无机盐等能自由通过。内膜(inner membrane)为选择透性膜，co2、o2、h2o可自由通过；pi、磷酸丙糖、双羧酸、甘氨酸等需经膜上的运转器(translocator)才能通过；蔗糖、c5c7糖的二磷酸酯、nadp+、ppi等物质则不能通过。1.叶绿体被膜叶绿体被膜(chloroplast envelope) 被膜以内的基础物质

8、称为基质(stroma)，基质以水为主体，内含多种离子、低分子的有机物，以及多种可溶性蛋白质等。基质是进行碳同化的场所，它含有还原co2与合成淀粉的全部酶系，其中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)占基质总蛋白的一半以上。此外，基质中含有氨基酸、蛋白质、dna、rna、脂类(糖脂、磷脂、硫脂)、四吡咯(叶绿素类、细胞色素类)和萜类(类胡萝卜素、叶醇)等物质及其合成和降解的酶类，还含有还原亚硝酸盐和硫酸盐的酶类以及参与这些反应的底物与产物，因而在基质中能进行多种多样复杂的生化反应。2.基质及内含物基质及内含物 基质中有淀粉粒(starch grain)与质体小球(plastogl

9、obulus)，它们分别是淀粉和脂类的贮藏库。将照光的叶片研磨成匀浆离心，沉淀在离心管底部的白色颗粒就是叶绿体中的淀粉粒。质体小球又称脂质球或亲锇颗粒，在叶片衰老时叶绿体中的膜系统会解体，此时叶绿体中的质体小球也随之增多增大。类囊体(thylakoid)是由单层膜围起的扁平小囊，膜厚度57nm，囊腔(lumen)空间为10nm左右，片层伸展的方向为叶绿体的长轴方向。类囊体分为二类：一类是基质类囊体(stroma thylakoid),又称基质片层(stroma lamella)，伸展在基质中彼此不重叠；另一类是基粒类囊体(grana thlylakoid)，或称基粒片层(grana lamel

10、la)，可自身或与基质类囊体重叠(granum)。片层与片层互相接触的部分称为堆叠区(appessed region)，其他部位则为非堆叠区(nonappessed region)。 3.类囊体类囊体 叶绿体基因的基本结构叶绿体基因的基本结构 叶绿体dna是由细菌内共生体的基因组演化而来的,是小的、双链环状dna分子,通常以多拷贝形式存在。叶绿体dna的一个显著特点就是不含有5甲基胞嘧啶,用这个特点可以大致检测叶绿体dna的纯度。叶绿体dna结构上大致可分为4个区,分别为大单拷贝区(large single- copy region)、小单拷贝区(single- copy region)和两个

11、等同的反向重复区(ira、irb)。 叶绿体基因组结构abdallah et al. (2000) trends plant sci. 5 141-142. 有一些植物如蚕豆、豌豆、苜蓿和松树中没有反向重复区,而纤细裸藻中含有3个拷贝的同向重复dna片段。从这个特点上,可将叶绿体基因组分为三类:一类是缺少重复序列的叶绿体基因组,二类是具有反向重复序列的叶绿体基因组,三类是具有同向重复序列的叶绿体基因组。叶绿体基因组叶绿体基因组-cpdna 叶绿体基因组在很多方面与线粒体基因组的结构是相似的。叶绿体dna（cpdna）是双链环状，缺乏组蛋白和超螺旋。cpdna中的gc含量与核dna及mtdna有

12、很大的不同。因此可用cscl密度梯度离心来分离cpdna 叶绿体基因组dna分子大小在120kb到217kb之间，相当于噬菌体基因组的大小，例如，t4噬菌体的基因组约165kb。一个叶绿体中通常有一个到几十个叶绿体基因组。叶绿体dna不含5甲基胞嘧啶，这是鉴定ctdna及其纯度的特定指标。每个叶绿体中cpdna的拷贝数随着物种的不同而不同。但都是多拷贝的。这些拷贝位于类核区。例如甜菜的叶细胞中每个类核体有48个拷贝的cpdna，而每个叶绿体有418个类核体，每个细胞中约有40个叶绿体。每个细胞总共有约6000 cpdna分子。在衣藻中（chlamydomonas）（单细胞生物）在细胞中一个叶绿

13、体含有5001500 cpdna分子。烟草和水稻（oryza sativa）叶绿体全序列分析表明cpdna基因组成有以下特点：1.基因组由两个反向重复序列（ir）和一个短单拷贝序列（short single copy seguence, ssc）及一个长单拷贝序列（long single copy seguence, lsc）组成；2.ira和irb长各10-24kb，编码相同，方向相反。3.cpdna启动子和原核生物的相似，有的基因产生单顺反子的mrna，有的为多顺反子mrna；4.尽管cpdna大小各不相同，但基因组成是相似的，而且所有基因的数目几乎是相同的，它们大部分产物是类囊体的成分或

14、和氧化还原反应有关；5.其trna基因（ira、irb上各有7个，lsc上有23个，共37个）中有内合子存在，最长者达2526bp，此和原核trna不同。有的内合子位于d环上，此和原核trna不同。有的内含子位于d环上，此和真核生物核trna内含子常位于反密码子环上也不相同；6.所有叶绿体基因转录的mrna都由叶绿体核糖体翻译。并不是所有的叶绿体都含有ir，ir上含有4种rrna基因，根据它们排列的情况叶绿体可分为3类：i类是ir 序列，4种rrna各有2个拷贝，对称分布在ir上cpdna也较大，如玉米、烟草、水稻、菠菜、地钱、衣藻（c.yreinhardi），大部分叶绿体都属此类。ii类：无

15、反向重复ir，而在cpdna一侧16s，23s以正向串联重复的形式（各3个拷贝）排列。如少数低等植物，裸藻（euglena gracilis）；iii类：无ir和dr，rrna只有一拷贝，如豌豆（posum satirum）等。这可能在进化的过程中dna片段的重复和倒位而造成的。在烟草叶绿体已发现的基因中,除了4个rrna基因即16s、23s、4.5s和5srrna基因外,还包括20个左右叶绿体核糖体蛋白基因,叶绿体rna聚合酶亚基基因、参与光合系统i和光合系统反应的基因、atp合成酶的亚基基因、电子传递链上酶功能复合体的基因、rubisco蛋白两个亚基中的一个亚基基因和30个trna基因等。

16、另外,从叶绿体dna顺序上看还有2634个功能未知的基因。 叶绿体基因的分子结构特点叶绿体基因的分子结构特点 叶绿体中的有些基因具有内含子,带有真核基因的显著特点。叶绿体基因组的内含子根据它的剪接边界序列和二级结构可分为i型、型、iii型和型四种,i型和型内含子与核基因组和真菌线粒体的i型和型内含子二级结构相似,i型内含子边界保守序列为gtgygry(5端)和rycnayy(y)ynay(3端),该类内含子的二级结构类似于型内含子,iv型内含子由于大小相似(95109bp)而被单独列为一类。高等植物叶绿体基因内含子许多是型内含子,叶绿体的内含子主要存在于编码蛋白的基因和trna基因上。 叶绿体

17、叶绿体dna大约含有大约含有60到到200个基因个基因,从功能上说从功能上说,叶绿体基因大叶绿体基因大致可分为致可分为3大类：大类：第一类是叶绿体遗传系统相关基因第一类是叶绿体遗传系统相关基因,如编码如编码rrna、trna、核糖、核糖体蛋白、起始因子等基因体蛋白、起始因子等基因;第二类是与光合作用相关基因第二类是与光合作用相关基因;第三类是与氨基酸、脂类、电子传递功能和色素生物合成有关第三类是与氨基酸、脂类、电子传递功能和色素生物合成有关基因。基因。rrn基因 叶绿体的rrn基因即核糖体rna(即rrna)基因,高等植物rrna基因主要编码16s、23s、4.5s和5s rrna。叶绿体核糖

18、体的沉降系数大约是70s,其中50s亚基主要包括23s、4.5s和5s rrna,30s亚基仅包括16s rrna在绿藻和衣藻中没有4.5s rrna,却存在另外两种独特的rrna即3s和7srrna。许多核糖体rna基因与大肠杆菌同源,如玉米、烟草与大肠杆菌的16srrn基因同源性都达到74%,烟草、玉米与大肠杆菌的23srrn基因同源性分别达到69%和71%,它们之间较高的同源性有助于研究进化的分子机制。 玉米的rrn基因位于ir区,所以每个基因有两个拷贝,而有些没有ir序列的植物如蚕豆等只有一个拷贝的rrn基因。 许多高等植物rrn基因之间存在明显的间隔区,例如玉米的叶绿体rrn基因的结

19、构是16s rrn(1490bp)间隔区(2100bp) -23s rrn (2890bp) -4.5s rrn(95bp)-间隔区(231bp)-5s rrn(122bp),一些trna基因分布在这个基因簇的间隔区中,如玉米的trn i和trn a基因就存在于16s和23srrn基因的间隔区。trn基因 叶绿体trn基因指的是转录成trna的基因。叶绿体大约有20-40个trn基因，烟草中有30个trn基因，和烟草相比，地钱中有一个烟草中没有的trn基因，该基因转录为trnaarg(ccg），叶绿体申蛋白质合成所需要的trna都由叶绿体基因组编码。叶绿体trn基因编码的trna都没有3cca

20、端。叶绿体trn基因比较集中在ir区。一些trn基因具有内含子,如玉米叶绿体中trng-ucc基因在d环区内有一个内含子,这是叶绿体所特有的trna基因结构特征。 叶绿体23srrn基因存在的保守区编码它的功能区,即核糖体蛋白的结合部位和30s-50s核糖体亚基相互作用的部位。4.5s rrna与原核生物的23s亚基的3端同源。从进化上说,4.5srrn基因可能来源于23rrna的3端。而高等植物的5srrn基因高度保守。 trn基因基因叶绿体trn基因指的是转录成trna的基因。叶绿体大约有2040个trn基因,烟草中有30个trn基因,和烟草相比,地钱中有一个烟草中没有的trn基因,该基因

21、转录为trna arg(ccg),叶绿体中蛋白质合成所需要的trna都由叶绿体基因组编码。叶绿体trn基因编码的trna都没有3-cca端。叶绿体trn基因比较集中在ir区。 在陆地植物上,trn基因分散在整个叶绿体基因组上-在裸藻中大多数trn基因成簇存在。裸藻叶绿体基因组中在16s trn基因前导序列上存在一个trnaile假基因,这是首先在叶绿体基因组中发现的假基因。在单子叶植物中至少有5个假基因存在,这些假基因位于反向重复序列附近。如果完全按照密码子的摆动学说,现在植物中的trna还不够识别所有的密码子,研究者提出”三中读二”(two-out亠0f three)的假说,即当密码子与反密

22、码子相互作用时,密码子前两个碱基被反密码子配对就足以识别该密码子,而第三个碱基只起一种隔开的作用，从而防止移码错读,该假说初步在体外试验中得到证实。核糖体蛋白质基因的分子结构 叶绿体中约有60种不同的核糖体蛋白,但是只有约1/3的蛋白由叶绿体基因所编码。叶绿体核糖体蛋白基因与大肠杆菌该类基因的同源性要低于rrn基因,分析一些核糖体蛋白基因的组成,大约与大肠杆菌的同源性在50%左右。其中,叶绿体rps23操纵子的顺反子排列和大肠杆菌的s10、spc和a操纵子中的同源顺反子相似,也说明叶绿体和大肠杆菌基因组可能起源于同一套祖先基因组。 但是,叶绿体中有些核糖体蛋白和任何细菌的核糖体蛋白都没有相似性

23、,也展示了叶绿体核糖体蛋白独特的一面。核糖体蛋白质基因中也发现有内含子的存在,如高等植物叶绿体中的核糖体蛋白基因rps16和rpl16各含有一个内含子。其他蛋白质基因的分子结构 现在,已经有很多编码蛋白质的基因在叶绿体中被分离出来,如光合作用相关基因rubisco大亚基rbcl基因、光合系统i和基因、细胞色素b/f复合体基因(pet或psb)、翻译因子基因、nadh脱氢酶基因(ndh)、atp合成酶亚基(atp)基因等。这些基因都是由叶绿体基因编码的,有的含有内含子。拟南芥叶绿体基因组可以编码79种蛋白质。 通过对叶绿体基因的分析表明叶绿体基因与细菌基因具有很大的相似性,主要表现在以下几点,一

24、是启动子序列中有类似细菌基困的10区和35区的结构,但位置可能有所差异;二是转录终止序列的转录终止位点存在互补序列,可形成与细菌类似的转录终止茎环结构;三是转录产物中含有类似细菌的sd序列,与翻译起始有关;四是有些相邻基因之间共转录形成顺反子(cistron),所以翻译起始和终止密码子有时重叠;五是叶绿体蛋白质翻译起始的氨基酸为甲酰蛋氨酸,这点与细菌相同; 六是叶绿体中一些基因与细菌基因同源性较高,如rna聚合酶、亚基的基因与大肠杆菌的核心酶基因同源,但是编码亚基的基因含有一个内含子。叶绿体基因有一些也与原核基因不同的特征,具有自己的独特性,如:16s-23s基因之间存在较大的间隔区,trna

25、基因不编码3-cca末端,有些基因具有内含子等。叶绿体dna具有独立进行复制、转录和翻译的功能，因而是高等植物中遗传信息的三种载体之一。它编码了叶绿体本身使用的全部rrna和trna，以及近90种多肽。不过，叶绿体和线粒体一样，只是半自主性的遗传体系，其绝大多数蛋白复合体是由核基因组和叶绿体基因组共同编码的； 随着分子遗传学和分子生物学等实验方法和技术的发展，叶绿体生物学的研究也进入了一个崭新的阶段。目前，已经有109种植物完成了叶绿体基因组测序(截至2009年4月1日)，主要包括烟草、番茄、马铃薯、菠菜、拟南芥、小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、棉花、胡萝卜、葡萄、杨树等等。目前已完成叶绿体基因

26、组测序的植物目前已完成叶绿体基因组测序的植物叶绿体基因组的一个有趣特征是，其参与光合作用的基因以若干小簇排列一起。这种结构从地钱到高等植物都趋于一致，即为保守的。这些基因簇不仅代表了光诱导基因表达的转录单位，而且也是调控单位。叶绿体转录水平的调节叶绿体转录水平的调节 nep和pep相互关系及协同调控基因表达o叶绿体dna构型的改变 o叶绿体dna的甲基化叶绿体基因由两种rna聚合酶催化转录，一种rna聚合酶由叶绿体基因组编码，称为pep聚合酶；另一种rna聚合酶由核基因编码，称为nep聚合酶；pep聚合酶与细菌中的rna聚合酶很相似，具有原核生物的特性。含有核心酶、和亚基，并由核基因编码的因子

27、，识别原核型启动子，nep聚合酶与t3/ t7噬菌体rna聚合酶相似。大多数情况下，pep聚合酶主要负责与光合作用有关的基因的转录，如psba, psbd 和 rbcl，而nep主要转录那些叶绿体转录和翻译的功能元件，如rpoa和 rpob，而那些看家基因常常既具有pep启动子，又具有nep启动子，他们被pep和nep共同转录，如clp等。nep由核基因编码，并转运到质体（plastid）和线粒体（mitochondrion）中发挥作用。定位到质体中的nep负责转录编码pep中心亚基的基因。叶绿体的发育过程由叶片根部到叶片顶部。随着叶绿体的发育，nep控制的转录本可能rna的稳定性（rna s

28、tability）逐渐降低，转录活性逐步提高，从而nep控制的转录本的积累几乎没有改变；而pep控制的转录本rna的稳定性不变或者增强，转录活性提高，从而pep控制的转录本的表达量增加。叶绿体基因组还可以通过叶绿体dna构型的改变和叶绿体dna的甲基化在转录水平上进行调控。叶绿体基因的转录后加工叶绿体基因的转录后加工 o叶绿体mrna的剪切o叶绿体rna的编辑 o叶绿体mrna的稳定i，ii，iii类内含子剪切机制 mrna的稳定性可以调节基因的转录水平。如果mrna稳定,存在时间长,就会由于积累效应从而提高基因的转录。现在已经发现许多叶绿体的基因mrna稳定性与其3端非翻泽区的短反向重复序列

29、(ir)有关,如果去除这些ir序列,mrna就会降解。叶绿体基因组的转录后调控，主要分为叶绿体mrna的剪切，叶绿体mrna的编辑 ，叶绿体mrna的稳定。pdm1蛋白的ppr结构域模型 ppr蛋白（ppr repeat）和rna形成复合物，但需要一个催化因子或催化座位（catalytic cofactor or domain）来实现对rna的加工。pdm1-1和pdm1-2呈白化表型pdm1-1生长量远小于野生型植株pdm1突变体的生理生化特征对几种光诱导表达的基因的表达调控机理对几种光诱导表达的基因的表达调控机理关于光对叶绿体基因转录过程的调控，目前研究得最多的是rbcl和psba两种基因

30、。人们相继在芥菜、豌豆、绿豆、烟草和菠菜等材料中发现，它们的转录水平因光诱导而明显上升。个中机理十分复杂，目前在此方面的认识还相当贫乏，只大致知道：植物对于光刺激的效应有多种类型，并与光质和光量有关：光诱导的光基因转录水平的提高，是由光受体介导的。在已知的三种光受体中，对介导红光的光敏色素性质相对明了，其余两种分别介导蓝光和紫光的隐性色素和uv-b，尚知之甚少。至于感受光调控的dna元件，则至少包括基因5末端上游的启动子区域。 光合作用基因工程的主要目标光合作用基因工程的主要目标 长久以来，人类一直在想方设法提高作物的生产力，而提高作物光合效率便是实现这一目标的主要措施之一。然而，植物利用太阳

31、能的效率相当低，通常不到5。即便是我国南方亩产高达1500千克的水稻，对光能的利用率也只近乎4。若能在原有基础上将作物光能利用率提高12，农作物产量将成倍增长。因此，许多科学工作者都把进一步提高粮食作物产量的希望寄托在提高光合效率的途径上。特别是如何设法提高占全世界粮食总产量50左右的水稻、小麦、玉米、高粱等8种重要粮食作物的光合效率，已成为植物基因工程研究中活跃纷繁的领域之一。 提高作物光合效率，一方面是通过遗传改良提高作物自身的光合能力，即提高光合强度（通常以每小时每平方分米叶面积吸收的co2毫克数表示，它一般已减去了光呼吸作用所释放的co2量）；另一方面则是通过合理的栽培管理（如提高复种

32、指数、合理密植、适当延长生育期等）以提高光能利用率。对于前者，除通过改良植株形态结构（株型），在确保不破坏群体内生态环境前提下适当增大光合面积外，重点寄希望于提高植株机体内部碳固定的效率及光能的吸收和转化效率。基于对光合作用机理的透彻了解，目前光合作用基因工程的主要目标有两方面。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶在光合作用中无可替代的作用，决定了它势必成为旨在提高作物光合效率的基因工程之主攻目标。因此，深入了解1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的一些分子生物学特性无疑是必要的。11，5-二磷酸核酮糖羧化酶二磷酸核酮糖羧化酶15-二磷酸核酮糖羧化酶除了具有上述催化活性之外，其本身还是一种量丰质优的蛋白质。尽管1

33、，5-二磷酸核酮糖羧化酶只存在于叶绿体中，但它占植物叶子中可溶性蛋白的一半以上，并因此被认为是地球上含量最丰富的蛋白质。并且，它是植物体内一种重要的贮存蛋白。有关学者研究了大豆籽粒在蛋白质合成过程中其氮的来源，发现其50是从储存于叶片中的15-二磷酸核酮糖羧化酶降解转移而来的。就蛋白质质量而言，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶含有丰富的必需氨基酸，因而不失为一种具有潜在开发价值的优质蛋白。高等植物的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶是非常大的酶，大多数真核和原核1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的分子量为560kd，由8个小亚基（rbcs，1218kd）和8个大亚基（rbcl，5260kd）组成。rbcs是由核基因

34、编码，rbcl则是由叶绿体基因编码的，其结构见图10-5。大亚基一般由475个氨基酸组成。各种生物来源的大亚基氨基酸序列除了烟草和大麦是直接由蛋白质测定氨基酸序列外，其余均是从相应基因的核苷酸序列推测所得。不同生物来源的大亚基之间同源性达80以上。（1）1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的基本结构 例如，玉米和菠菜的大亚基核苷酸序列同源性为84，而相应的氨基酸序列同源性却达97。小亚基由123个（小麦为128个）氨基酸组成，不同植物来源的小亚基氨基酸序列已测定，它们之间的同源性要比大亚基之间的同源性相对低得多。也就是说，小亚基之间有明显的种间差别，而大亚基之间无种的差别。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活

35、性部位二磷酸核酮糖羧化酶的活性部位 由大亚基负责rudp羧化作用：第一，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶可被诱导分离成亚基，且这些亚基还能重新结合成原来的酶。如果该酶以大亚基的八聚体形式存在而完全不含小亚基，它仍保留部分羧化酶的活性（比活约20）；第二，在某些细菌（深红红螺菌、中间硫杆菌）中，这种酶仅含有大亚基，其活性并不依赖于小亚基的存在；第三，分别制备了从菠菜1，5-二磷酸核酮糖羧化酶中纯化的大亚基的抗血清。加入对大亚基特异的抗血清，就会抑制全酶的羧化酶活性；反之，加入对小亚基特异的抗血清却无影响； 第四，菠菜和色素菌的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶功能所必需的某些sh基团和赖氨酸残基都在大亚基上；

36、第五，由于对1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的羧化酶活性的选择压力极大，含有活性部位的亚基在进化方式上要比另一种亚基保守得多。对大范围被子植物研究的结果揭示，大亚基中含有40个氨基酸的n-末端序列的改变远比小亚基少得多。从而间接证明了1，5-二磷酸核酮糖羧化酶行使催化功能的活性部位在大亚基上，并有人推测羧化作用和加氧作用是在大亚基的同一部位进行的。小亚基之间尽管有明显的种间差别，但其氨基酸序列中也有一些区域具有较高的同源性，这暗示在这些部位可能也有某种功能。不过，小亚基的实际功能至今仍不明了。也许它起着某种稳定作用，导致大亚基的构象变化，或者由于小亚基的存在，促使1，5-二磷酸核酮糖羧化酶更为有效地

37、分辨对o2和co2的反应。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性表达 有实验表明，小亚基的存在是维持该酶的活性所必不可少的。但仅有大、小亚基还不够，在大、小亚基组装为有活性的全酶过程中需要有第三种蛋白质的帮助，即亚基结合蛋白。另外，酶的活化也受到许多因素的影响，光便是其中之一。实验结果发现，苜蓿叶子粗提液中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的初活性随光强增加而增加，并和光合作用强度的增加相伴随，烟草光下生长的叶子的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶初活性比黑暗处理的叶子约高1倍。不过，这种有可能被光照解除的暗抑制作用，并非普遍存在于所有植物中。大豆、烟草、马铃薯及扁豆中存在这种现象，而在玉米、小麦、菠菜等作物中却未

38、发现。 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶基因及其表达 每个叶绿体dna分子中，大亚基以单拷贝形式存在。由于每个叶绿体有10200个dna分子，每个细胞又有10200个叶绿体，因而每个细胞可能存在几千个拷贝的大亚基基因。如今，玉米、大麦、烟草、菠菜等植物及某些蓝细菌的大亚基已被克隆并进行了序列分析，而对更多的物种来说，已获得其全部或部分的氨基酸序列。到目前为止，所有已被测序的高等植物rbcl基因都是连续的，即无内含子，长约1.4kb。rbcs却不同，它由核基因组中的多基因家族编码。大豆的rbcs多基因族至少有10个成员，豌豆中5个，番茄中也有5个，矮牵牛中8个，浮萍中13个。另外，rbcs基因中常有内

39、含子存在。rbcl和rbcs基因的表达均受光的促进及发育过程的调节。也就是说，光能诱导它们进行表达；植株在生长发育的不同阶段，它们表达与否以及表达效率高低都有所差别。高等植物中rbcl基因和rbcs基因之所以令学者们兴趣盎然，原因在于：其一对rbcl和rbcl基因表达特征（包括光的调控）的研究具有普遍意义。因为rbcl的表达对叶绿体基因的表达有代表性，rbcs基因族的表达对核基因尤其是多基因家族的表达有代表性；其二，由于rbcl和rbcs分别由叶绿体基因组和核基因组编码，并且两者以相同的分子数共同组配成1，5-二磷酸核酮糖羧化酶，因此，这是一个了解核和叶绿体如何协同表达某一基因的完美模型。基于

40、上述对1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的了解，通过基因工程技术改变1，5-二磷酸核酮糖羧化酶羧化作用和加氧作用的相对比率，主要从以下几个方面进行尝试：（1）通过交换1，5-二磷酸核酮糖羧化酶亚基的基因，将不同来源的基因通过优化组合导入同一种植物，形成具有异源亚基的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶。（2）采用定点突变技术，改变1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，增加其同co2的亲和力。（3）用更为有效的突变基因，取代正常的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶基因。（4）增加1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基拷贝数或提高转录效率，从而增加rudp羧化酶的量。在植物的光合作用中，光能的吸收、传递和转化等过程，几乎都是在镶嵌于

41、叶绿体类囊体膜上的反应中心色素蛋白复合体的有关电子传递链中进行的，即由ps和ps协同完成。每一光系统都各有独特的色素蛋白复合物及另一些物质。ps的颗粒较小，在类囊体膜的外侧，其叶绿素a与叶绿素b比值高；ps颗粒较大，在类囊体膜外侧，其叶绿素b含量相对较高。2类囊体膜上的蛋白复合体类囊体膜上的蛋白复合体 类囊体膜上含有由多种亚基、多种成分组成的蛋白复合体，主要有四类，即光系统（psi）、光系统（ps）、cytb6/f复合体和atp酶复合体（atpase），它们参与了光能吸收、传递与转化、电子传递、h+输送以及atp合成等反应。由于光合作用的光反应是在类囊体膜上进行的，所以称类囊体膜为光合膜类囊体

42、膜上的蛋白复合体及电子传递示意图这四类蛋白复合体在类囊体膜上的分布大致是：ps主要存在于基粒片层的堆叠区，ps与atpase存在于基质片层与基粒片层的非堆叠区，cytb6/f复合体分布较均匀。ps中放氧复合体(oxygen-evolving complex,oec)在膜的内表面，ps的原初供体位于膜内侧，原初受体靠近膜外侧。质体醌(plastoquinone,pq)可以在膜的疏水区内移动。cytb6/f复合体在膜的疏水区。ps的电子供体pc在膜的内腔侧，而ps还原端的fd、fnr在膜的外侧。蛋白复合体及其亚基的这种分布，有利于电子传递、h+的转移和atp合成。 psb rd1d2z tyrqa

43、qb25-28 kdalhc iichl a/bcp 29cp 26cp 24cp 43cp 47psb hpsb kpsb cpsb bpsb dpsb achl p680d tyrpheophytinmn mnmn mnpsb opsb ppsb qpsb fpsb ecytb559psb lpsb ipsb spsb npsb mpppppppstromathylakoidlumenorganization of photosystem ii subunitsorganization of photosystem i subunitspsi-opsi-gpsi-bpsi-opsi-lps

44、i-jpsi-hpsi-ipsi-kpsi-fpsi-alhca3lhca2/3lhca4lhca1lhca2lhca2/3lhca4lhca15 nmstroma lamellastromathylakoidlumenpsi-npcfnrpsi-epsi-cpsi-dfda0a1p700fxfbfa在各种植物中已确定了在各种植物中已确定了41个编码光合固碳和电子传递装置组分个编码光合固碳和电子传递装置组分的基因的基因 包括rbcl、ps的5个亚基（psa基因）、ps的14个亚基（psb基因）、h+-atp合成酶的6个亚基（atp基因）、细胞色素b/f复合物的5个亚基（pet基因）以及nadh

45、脱氢酶的10个亚基（ndh基因） 在拟南芥叶绿体中存在五类蛋白酶 ：ftsh蛋白酶 功能：特异性的降解未组装的和发生错误折叠的蛋白从而对蛋白进行质量控制。degp蛋白酶 拟南芥中的deg蛋白酶deg1 deg5deg8deg2叶绿体囊腔侧叶绿体的蛋白酶叶绿体基质侧降解光破坏的d1蛋白参与psii的修复与d2相互作用参与光系统组装体外降解光破坏的d1蛋白依赖于gtp的蛋白酶deg7降解损伤的光系统蛋白d1、d2、cp47、cp43与deg5、deg8协同作用参与psii的修复循环形成复合物，降解光破坏的d1蛋白，从而参与psii的循环修复与类囊体膜结合lon蛋白酶分布：原核生物与真核生物的丝氨酸

46、蛋白酶功能：控制蛋白的命运；控制基因的表达； 蛋白酶功能、分子伴侣功能。lon1蛋白酶参与萌发后的生长调控以及具有调节线粒体的稳定性的功能。叶绿体基因组转化的原理叶绿体基因组转化的原理叶绿体基因组转化技术之所以能够实现，主要是基于以下原理和方法:(1)利用了同源重组 (homulogous recombination)机制，将外源基因定点整合到叶绿体基因组。在构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因的两侧各连接一段叶绿体的dna序列，这两个片段称为同源重组片段或定位片段(targeting fragment)。当载体导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的同源片段发生重组，外源基因就可以整

47、合到叶绿体基因组的特定位点 。(2)采用筛选标记基因实现叶绿体基因组的同质化(homoplasmy)。由于叶绿体基因组通常以高拷贝数存在，一般每个细胞有成千上万个叶绿体基因组，因而同时转化这么多基因组几乎是不可能的，极易出现转化的和未转化的叶绿体组成的异质体(heteroplasmy)，无法保证获得的性状稳定遗传下去。因此叶绿体基因组转化所面临的一个关键问题就是去除未转化的基因组和未转化的叶绿体。这个问题的解决是通过向叶绿体表达载体中加入筛选标记基因，转化后进行抗性筛选，淘汰未转化的叶绿体，以实现转化叶绿体基因组的同质化。(3)采用叶绿体特异的启动子和终止子实现外源基因的高效表达。为了使外源基

48、因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，在构建转化载体时，一般选用叶绿体来源的启动子和终止子。例如常用的启动子为叶绿体的16srrna基因的启动子prrn和光系统作用中心的启动子ppsba;常用的终止子为叶绿体的psaa基因的终止子tpsba和rps16基因的终止子trpsl6由于使用了叶绿体来源的启动子和终止子，从而可以保证外源基因在叶绿体中的正常表达。目前外源基因导入叶绿体的方法主要有基因枪转化法、peg介导转化法、花粉管导入法、农杆菌介导转化法、显微注射及激光注射法和转运肤介导的叶绿体间接转化法等，其中最常用并且能够获得稳定质体转化体的方法是基因枪法和peg法。叶绿体基因组转化的方法叶绿体基因组转化的方法叶绿体转化系统的特点叶绿体转化系统的特点目的基因的转化效率高由于叶绿体基因组的拷贝数非常大，如一个成熟的植物叶肉细胞中可含190050000份叶绿体基因组，整合在其中的外源基因也会以高拷贝存在，这就为外源基因的高效表达提供了条件。例如，5678 等将生物可降解多肽基因导入叶绿体，其表达量是核表达的倍。目前，多数学者认为叶绿体基因组在植物细胞内以多拷贝形式存在是目的基因转化效率高的主要