第七章微生物的研究方法1

1、第七章第七章 微生物的研究方法微生物的研究方法灭菌灭菌配制培养基配制培养基纯种分离纯种分离鉴定鉴定菌种保藏、复壮菌种保藏、复壮菌落形态菌落形态菌体形态菌体形态生理生化实验生理生化实验第一节第一节 配制培养基和纯种分离配制培养基和纯种分离 一、培养基一、培养基 按照培养基制成的形式，可分为按照培养基制成的形式，可分为（1）液体培养基：）液体培养基：增殖、鉴定微生物增殖、鉴定微生物（2）固体培养基两种：）固体培养基两种：分离、保藏菌种及鉴定微生物分离、保藏菌种及鉴定微生物 a 平板培养基：平板培养基：分离、鉴定微生物分离、鉴定微生物 b 斜面培养基：斜面培养基：培养、保藏菌种培养、保藏菌种另：常用

2、的凝固剂是琼脂另：常用的凝固剂是琼脂(洋菜洋菜)，当加入，当加入1.53时时就形成固体，而加入就形成固体，而加入0.50.8时，则成半固体。时，则成半固体。 培养、分离微生物常用的培养基培养、分离微生物常用的培养基二、纯种分离二、纯种分离u工具工具 接种针、接种环、接种钩、玻璃涂棒、移液枪接种针、接种环、接种钩、玻璃涂棒、移液枪u 方法方法 平板涂布法平板涂布法 倾注平板法倾注平板法 平板划线法平板划线法第二节第二节 灭菌灭菌 一、概念一、概念消毒：指只杀死一部分微生物，主要是病原微生物消毒：指只杀死一部分微生物，主要是病原微生物 灭菌：指杀死一切微生物，包括芽孢和孢子灭菌：指杀死一切微生物，

3、包括芽孢和孢子物理法物理法化学法化学法热灭菌热灭菌紫外线和射线紫外线和射线 15 w紫外灯紫外灯过滤过滤干热干热湿热湿热灼烧灼烧烘烤烘烤消毒剂消毒剂 75 %乙醇、甲醛、乳酸、石炭酸、石灰乙醇、甲醛、乳酸、石炭酸、石灰 水、水、 福尔马林、新洁尔灭、龙胆紫等福尔马林、新洁尔灭、龙胆紫等防腐剂防腐剂 有机汞、有机锡、酚类等有机汞、有机锡、酚类等160 2h/ 170 1.5h121 15-30min 适用范围最广适用范围最广高压高压常压常压 巴氏消毒巴氏消毒 间歇灭菌间歇灭菌二、方法二、方法干燥热空气灭菌注意事项干燥热空气灭菌注意事项(1) 灭菌的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌灭菌

4、的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。中容易炸裂。(2) 灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。(3) 灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。花被烤焦。(4) 灭菌温度恒定在灭菌温度恒定在160170为宜。温度超过为宜。温度超过180，棉花、，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。报纸会烧焦甚至燃烧。(5) 降温时，需待温度自然降至降温时，需待温度自然降至60以下才能打开箱门取出物以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。品，以

5、免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。(6) 培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。湿热灭菌注意事项湿热灭菌注意事项(1) 每次使用前，应检查灭菌锅内有足够水量，使水位过电热管。每次使用前，应检查灭菌锅内有足够水量，使水位过电热管。(3) 摆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出气孔，必须留出空位摆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出气孔，必须留出空位保证其畅通放汽。保证其畅通放汽。(4) 每次开锅前，一定要检查确认锅内无压力！压力指示表必须每次开锅前，一定要检查确认锅内无压力！压力指示表必须指示为指示为0！(5) 如果使用仪器的过程中发现有超温及

6、超压等异常现象，请断如果使用仪器的过程中发现有超温及超压等异常现象，请断开电源，开关处于开电源，开关处于OFF位置，并将插头从电源处拔下，待机器压位置，并将插头从电源处拔下，待机器压力降下来为零时，再打开锅盖进行检查。力降下来为零时，再打开锅盖进行检查。(6) 灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4 体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。(7) 使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100

7、后，后，开始计算灭菌时间开始计算灭菌时间 在相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好的原因：在相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好的原因：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，蒸汽存在潜热，当气体转变为

8、液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。故可迅速提高灭菌物体的温度。 在微生物实验室中所采取的预防杂菌污染的一切操作在微生物实验室中所采取的预防杂菌污染的一切操作措施，主要包括创造无菌环境、使用无菌器材和遵循无措施，主要包括创造无菌环境、使用无菌器材和遵循无菌操作规范。菌操作规范。 无菌环境：酒精灯、超净工作台、无菌室无菌环境：酒精灯、超净工作台、无菌室 无菌器材：无菌器材： 无菌操作规范：无菌操作规范： 三、无菌操作三、无菌操作第三节第三节 微生物的观察微生物的观察一、菌落形态一、菌落形态大小大小 极小（极小（1mm）;小（小（1-2mm）；中等（）；中等（2-4mm）；大（）；大

9、（4mm）表面表面 光滑、皱褶、粗糙、同心环龟裂光滑、皱褶、粗糙、同心环龟裂边缘边缘 整齐、波状、齿状、卷毛状、轮纹状、木耳状、缺刻状整齐、波状、齿状、卷毛状、轮纹状、木耳状、缺刻状隆起隆起 扁平、略高、微凹、半球、瘤状扁平、略高、微凹、半球、瘤状 突起多丘陵状突起多丘陵状颜色颜色 光泽光泽 闪光、不闪光、金属光泽闪光、不闪光、金属光泽透明透明 不透明、半透明、透明不透明、半透明、透明质地质地 油脂、膜、粘稠状、脆油脂、膜、粘稠状、脆形状形状 圆形、放射状、假根状、丝状伸展蔓延、分枝状圆形、放射状、假根状、丝状伸展蔓延、分枝状一、菌体形态（镜检）一、菌体形态（镜检）1 1、工具、工具 显微镜显

10、微镜普通光学显微镜：明视野、暗视野、相差、荧光普通光学显微镜：明视野、暗视野、相差、荧光电子显微镜：几十万倍至一百万倍电子显微镜：几十万倍至一百万倍 扫描电镜扫描电镜 透射电镜透射电镜二、染色二、染色观察观察u 活菌活菌 压滴压滴 悬滴悬滴 美兰染色美兰染色u 方法方法正染正染 单染色法单染色法 不能鉴别不能鉴别 复染色法复染色法 可鉴别可鉴别 革染、抗酸性染色革染、抗酸性染色负染负染 荚膜荚膜其它其它二、测大小二、测大小测微尺测微尺 目镜测微尺目镜测微尺 镜台测微尺镜台测微尺步聚：步聚：装入目镜装入目镜 台测微尺夹于载物台台测微尺夹于载物台 调好光线、焦距、晴晰看到刻度调好光线、焦距、晴晰看到刻度 移到台微尺、转目微尺，使两者刻度第一移到台微尺、转目微尺，使两者刻度第一 条线重合，向条线重合，向 左找出另外重合线左找出另外重合线 记录两尺重叠格数，公式计算记录两尺重叠格数，公式计算第三节第三节 保藏与复壮保藏与复壮 目的目的 不致死亡、绝种、不污染杂菌、保优不致死亡、绝种、不污染杂菌、保优 良性状良性状 原理原理 代谢处于不活跃、生长繁殖受抑制代谢处于不活跃、生长繁殖受抑制 低温低温 干燥干燥 缺氧缺氧一、保藏一