色谱分析概论

1、 色谱分析法概论色谱分析法概论 chromatography 色谱法概述 色谱过程和术语 色谱法基本理论 基本类型色谱的分离机制 主要内容：主要内容： 色谱过程和分离原理色谱过程和分离原理 基本概念和计算公式基本概念和计算公式：保留值、分配系：保留值、分配系数数K K、容量因子、容量因子k k、n n、H H、R R 色谱基本理论：塔板理论、色谱基本理论：塔板理论、速率理论速率理论 基本类型色谱机制基本类型色谱机制一、色谱法（一、色谱法（chromatograph）的起源和发展）的起源和发展 11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离植物色素分离见图示 2、1931年胡萝卜素异构

2、体的分离 3、3040年代TLC、PC平板色谱法的出现 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、 吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用 7、70年代HPLC崛起图示固定相固定相CaCO3颗粒颗粒流动相流动相石油醚石油醚 2现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相固定相除了固体，还可以是液体除了固体，还可以是液体 流动相流动相液体或气体液体或气体 色谱柱色谱柱各种材质和尺寸各种材质和尺寸 被分离组分被分离组分不再仅局限于有色物质不再仅局限于有色物质定义：利用各组分物理化学性质的不同

3、，在流动相流定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。动，最终达到分离的目的。图例图例分离基础：差速迁移分离基础：差速迁移 (例例:赛跑赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析目的：多组分分离，实现定性定量分析图示分离机制：分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开碳酸钙碳酸钙吸附剂吸附剂石油醚石油醚流动相流动相色素

4、气相色谱气相色谱：流动相为气体（称为载气）流动相为气体（称为载气） GCGC 按固定相不同分为：气固色谱按固定相不同分为：气固色谱 (GSC)(GSC) 气液色谱气液色谱 (GLC)(GLC)三、色谱法分类：三、色谱法分类： 1按两相分子的聚集状态分：按两相分子的聚集状态分：液相色谱液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）流动相为液体（也称为淋洗液） LCLC 按固定相的不同分为：液固色谱按固定相的不同分为：液固色谱 (LSC)(LSC) 液液色谱液液色谱 (LLC)(LLC)。2按固定相的固定方式分：按固定相的固定方式分：续前3按分离机制分：按分离机制分： （ partition chroma

5、tography） （ absorption chromatography） （ion exchange chromatography ） （size exclusion chromatography） 色谱法简单分类色谱法简单分类色谱法色谱法GSC液相色谱法液相色谱法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCSECIEC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法气相色谱法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 （SFC）优点：优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：缺点：一、色谱过程二、

6、基本术语1、流出曲线和色谱峰2、基线、噪音和漂移3、峰宽柱效参数4、峰高和峰面积定量参数5、保留值定性参数6、分配系数和容量因子相平衡参数7、等温线8、分离因子和分离度分离参数色谱过程：指物质分子（被分离组分分离组分）在相对运动的 两相（流动相流动相和固定相固定相）中的“分配”平衡 过程以吸附色谱为例色谱过程： 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离 流出曲线（色谱图流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线 色谱峰色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分 base line, noise and drift基线基线：仅有流动相

7、通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲线 （稳定平直直线）噪音噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小）漂移漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）峰宽峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距标准差标准差： 为正态分布曲线两拐点间距离的一半。 对应0.607h处峰宽的一半注：小，峰窄，柱效高半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽355. 221W4W21699. 1WW 图示 峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。 保

8、留时间保留时间 retention time, tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间 死时间死时间dead time, t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间 调整保留时间调整保留时间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱种多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值0tttRR表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数（1）时间表示的保留值）时间表示的保留值图示续前保留体积保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。 VR与tR

9、和Fc（流动相流速mL/min）的关系 死体积死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、 柱出口导管及检测器内腔体积的总和。cRRFtVCRcRFtFV1无关；为定值，与注：310VVVVmCFtV00差，峰形，色谱峰扩展0V（2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值续前调整保留体积调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积CRRRFtVVV0cRcRFtFV1无关；与注：mSCCK 分配系数分配系数K（partition coefficient , 平衡常数）：指在一定温度

10、和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比在流动相中出现的几率为单位时间内一个分子设 R在固定相中出现的几率为单位时间内一个分子设1RmSmmSSVVKVCVCRR1mSVVKR11RRRtttLtLuuR000流动相的迁移速度度组分在色谱柱中迁移速) 1(R续前讨论：讨论： 色谱条件一定时，tR主要取决K的大小 （色谱法基本的定性参数 ）)1 (0mSRVVKtt色谱过程方程RtK分配系数K不容易获得，不常用容量因子容量因子（capacity factor, 容量比，分配比）k： 在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比msmmssmsVVKVCVCWWk000tt

11、tttkRR长注：Rtk不等是分离的前提不等或注：kK)1 ()1 (00kttVVKttRmSR容易获得，用的更多k 注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等)1 (0msBBRVVKtt)1 (0msAARVVKtt)(0BAmsBRARRKKVVtttt0RBAtKK定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相 中的浓度关系曲线，即中的浓度关系曲线，即cs对对cm的关系曲线的关系曲线 (1) 线性等温线线性等温线（理想）（理想）对称峰对称峰(2)非线性等温线非线性等温线凸形凸形拖尾峰拖尾峰（常见）（常见） 凹形凹形前沿峰前沿峰固定

12、相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小 溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加 对称因子对称因子：（拖尾因子）：（拖尾因子）fs在0.951.05之间fs小于0.95fs大于1.05ABAAWfhs2205. 0 对称因子对称因子(symmetry factor) 衡量色谱峰对称性衡量色谱峰对称性（1）分离因子（分配系数比或选择性系数） 定义：两种物质调整保留值之比121212RRttkkKK分离因子1是色谱分离的必需条件22112WWttRRR峰宽和之半）保留值之

13、差（峰顶间距)2(21)1 (21122112)(177. 1)(2WWttWWttRRRRR（2）分离度（）分离度（resolution, R）： 衡量色谱分离条件优劣的参数定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍讨论讨论 设色谱峰为正常峰，W1W2= 4 完全未分开定量分析前提）完全分离基本分离0 . 1(65 . 140 . 1RtRtRRR第三节第三节 色谱法基本理论色谱法基本理论 21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttR要使要使R R大，必须：大，必须：1 1、t tR R大大- - k k大大-热力学热力学2

14、 2、W W小小-峰展宽小峰展宽小-动力学动力学分离度：分离度： 色谱理论包括两方面色谱理论包括两方面:热力学理论：热力学理论：研究分配研究分配(分离分离)过程，塔板过程，塔板理论（理论（plate theory）。）。动力学理论：动力学理论：研究各种动力学因素对峰展研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（宽的影响，速率理论（rate theory）。）。一、塔板理论一、塔板理论 plate theory 。 。将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一段内，一部

15、分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板，经过多次分配平衡，分一个理论塔板，经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。系数大的组分后离开蒸馏塔。：1柱的组成为多个连续、等距塔板，每塔板内组分分配瞬间达 平衡（H理论塔板高度）2流动相间歇式进入色谱柱，每次进一个

16、塔板体积3样品和载气均加在第1号塔板上，沿柱方向纵向扩散忽略4分配系数在各塔板上是常数结果：当塔板数很大时，组分色谱流出曲线为趋 于正态分布理理HLn2221)(16)(54. 5WtWtnRR理L ：柱长色谱柱效参数色谱柱效参数，但柱压和分析时间一定，；，分离能力，柱效一定，讨论：理理理理理理理nLHnHLHnLn1不同；组分不同则与所用组分有关，选用注：计算理理nn一致无量纲，上下单位必须理n续前2212)(54. 5)(16WtWtnRReffeffeffnLH/0ttkR2)1(kknneff理理，实的反映柱效扣除了死时间，更能真和讨论：nnkHneffeffeff塔板理论的贡献：从热

17、力学角度塔板理论的贡献：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置提出了评价柱效高低的n和H的计算式须在给定条件，指定组分测定时才有意义缺点：缺点：22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理1.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。2.塔板理论无法解释同一色谱柱在不同流动相流速下柱效不同的 结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。二、速率理论二、速率理论 rate theoryrate theory塔板理论成功处塔板理论成功处：解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 评价柱效（n，）塔板理论存在问题塔板理论存在问题:1）做出了四个与实际不相符的假设 忽略

18、了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的 影响因素3）排除了一个重要参数流动相的线速度u， 因而无法解释柱效与流速关系 更无法提出降低板高的途径速率理论速率理论影响柱效因素 19561956年，荷兰学者范第姆特年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)(Van Deemter)提出了提出了色谱过程动力学理论色谱过程动力学理论速率理论。速率理论。塔板高度涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项H = A + B/u + Cu吸收了塔板理论的有效成果H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素u:线速度，cm/suBAHCuu/项可忽略，最佳uCAHBuu项可忽

19、略，最佳（测定）前提下和较短在保证足够大最佳utRR高，峰越尖锐，柱效，一定，三个常数注：nHuH = A + B/u + Cu 当色谱柱内的组分随流动相在固定相颗粒间穿行,朝柱出口方向移动,如果固定相颗粒不均匀,则组分在穿行这些空隙时碰到大小不一的颗粒而必须不断的改变方向,于是在柱内形成了紊乱的湍流流动使流经障碍情况不同的流路中的分子到达柱出口,而使谱带展宽图示back柱填充不均匀 产生原因：流动相产生原因：流动相携样品进柱，遇到来自固定相颗粒携样品进柱，遇到来自固定相颗粒 的阻的阻力路径不同涡流扩散 cmdpA单位2注：注：颗粒太小，柱压过高且不易填充均匀 空心毛细管柱（0.10.5mm）

20、，A=0，n理较高涡流扩散系数 ：填充不规则因子，：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。d dp p：填料：填料 ( (固定相固定相) ) 颗粒的平均直径，颗粒的平均直径， dp小，A小；但dp太小，和柱阻大。产生原因：产生原因： 由于组分的加入，在柱的轴向上形成溶度梯度，因此当组分以塞子形式随流动相流动的时候,以塞子状分布的分子自发的向前和向后扩散。这种由浓度梯度引起的其方向沿着轴向进行的的扩散,称为分子纵向扩散,其谱带展宽 B/u=2DmL/u Dm为分子在流动相中的扩散系数 为填料因子 产生原因：由于溶质分子在流动相和固定相中产生原因：由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、

21、转移的过程并不是瞬间达到平衡，的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽液相色谱的传质阻抗项Cu又分为：（1）流动相传质阻抗（2）固定相传质阻抗。流动相中的传质阻抗产生原因：组分从流动相扩散到两相界面需要一定的时间,该时间与扩散时经过的距离平方成正比,与组分扩散系数成反比,而扩散经过的路程决定于固定相间颗粒的大小,由于组分处在颗粒空隙间的不同位置,因此到达两相间的时间不同,从而使谱带展宽.固定相的颗粒直径越大组分到达两相界面的

22、时间越长.柱长越长,组分停留在流动相中的时间增加,传质阻力相应增加.引起谱带变宽Hmf1kd2u/Dm f1为常数 k为溶质的保留因子 d为固定相填料直径 Dm为溶质在流动相中的扩散系数 采用细颗粒的固定相,增大组分在在流动相中的扩散系数,适当降低流动相线速,选用短柱等均可使流动相传质阻力尽可能的减小固定相传质阻抗 组分从两相界面扩散到固定相内部,达到平衡后又返回两相界面时受到的阻力,称为固定相传质阻抗 Hs= f2 k (df)2Lu/ Ds f2为常数，k为溶质的保留因子，df为固定相或固定液膜的厚度，Ds为组份在固定相中的扩散系数 在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层

23、固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略 使固定相传质阻力减小的方法是采用低含量的固定液，以减小固定液液膜厚度。选用低粘度的固定液，增大组分在固定液中的扩散系数，适当提高柱温和和降低流速柱外效应 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应） 柱外效应主要由从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，其次进样时间要短，并将样品直接进在柱头的中心部位1分离度定义式 2分离度计算式)2(21)1(2112211

24、2)(177. 1)(2WWttWWttRRRRR前提前提定义式基础上，相邻两组分的定义式基础上，相邻两组分的n一致（假设）一致（假设） 22114kknR理理HLnuCuBAH/121212RRttkkKK（分离因子）柱效项柱选择项柱容量项影响色谱峰的宽窄主要取决于色谱柱性能及流速nR 因为HLn 已知LRLRH2或的条件下在不改变塔板高度22114kknR21221LLRRss注：柱长过长，柱阻增大续前 讨论：讨论：v 增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段v 提高柱效、改善分离的途径：增加柱长；降低板高v 根据速率理论，降低板高、提高柱效的方法是： 1）采用粒度较小、均匀填充的固定相（A

25、项 ） 2）分配色谱应控制固定液液膜厚度（C项 ） 3）适宜的操作条件： 流动相的性质和流速，柱温等等（B项 ） 22114kknR理理HLnuCuBAH/影响峰的间距 主要受固定相性质，以及柱温影响1R因为R，所以1，无法分离01R的影响都很大微小变化对R一倍R2 . 11 . 122114kknR121212RRttkkKK（分离因子）影响峰位影响峰位主要受固定相用量、柱温和载气流速的影响主要受固定相用量、柱温和载气流速的影响kkR100RkRkkk，1，峰扩张，的影响对时RtRk变慢时，Rkk5RtRkk很少，时，1022114kknR图示（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法对于不同的分离机理，K的含义不同。 吸附色谱 吸附