(完整word版)蛋白纯化AKTA操作说明

1、AKTA pure 操作说明分子筛层析操作步骤：1. 开机：打开 AKTA pure 开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2. 打开系统：打开电脑：双击Unicorn 7.0 打开系统，进入 log on 界面，用户名默认为Default ，输入密码： default ，点 ok 键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注 意 ： 进入系 统 时 会弹出 三 个界 面： SystemControl 界 面， Evaluation 界 面 和Administration 界面。其中 system Control 界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成： Manual-E

2、xecute Manual instructions-. ； Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口； Administration 界面为 Unicorn 7.0 系统设置界面。3.洗泵：把 A1 泵头从 20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在SystemControl 界面下，点击 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-点开 inlet ，选择 A1-Excuse 。4.设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -Execut

3、e ；设流速： Pumps-System flow -设置 system flow （1mL/min ） -Execute 。注意： 流速和柱压设置参照“GE 蛋白纯化柱表” ，不要超出最高限制。5. 装柱子 (先上后下 )：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。6.平衡柱子：分子筛 buffer 平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。7.设置系统及收集参数：命

4、 名：先 end-Manual instructions ，点击 browse，弹出 select result name&location面，点开文件夹“defaultHome ”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建 )，在界面下方“name”指令框进行命名。注意： 命名时要标明日期，柱子型号 ，样品名称 。设流速： Pumps-System flow- 设流速（ 1 mL/min ） -Execute ；设柱压： Alams- alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -点击 Execute；界洗 A 泵： Pumps

5、-Pump A wash- 点开 inlet ，选择 A1-Excuse ；紫外调零： Monitors-Auto zero UV-Execute ；设置收集体积：Fracton collection-peakfractionation-fractionsize-设置收集体积-Execute；一般设为1 mL( 可根据实际情况调整)。设置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level-设置起始收集水平 - Execute 。注意： 对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，如 10 mAU, 避免

6、损失蛋白。8.上样：冲洗 Loop 环：取 5mL 注射器，吸取5 mL 分子筛（不能有气泡） ，从进样口注射2 倍Loop 体积的分子筛来清洗Loop 环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（ 2 mL ），12000 rpm 离心 3 min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop 环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop 环中。Inject: 点击 Flow path-inj

7、ection valve-点开 position 选项 -inject-Execute- 走 2 倍 Loop体积的分子筛缓冲液；Load:点击 Flow path-injection valve-点开 position 选项 -manual load-Execute ，调回Load 状态。9.收集目标蛋白：参照标准蛋白曲线， 估计样品出峰位置， 收集蛋白样品， 做好标记，过完后，peak fracstop900 停止收集。10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出来，离子浓度平衡后，点击 pause，进分子筛的 buffer 的泵头用去离子水洗，放入 20%的乙醇中， continue- 洗泵

8、（ A1 泵），平衡柱子。 20% 的乙醇平衡柱子，一般要两小时左右，盐离子浓度达到0%。11.收柱子（先下后上）：调节流速至0.5 mL/min ，拧下柱下面的接头，连上注射器，再调流速至1 mL/min ，注射器内吸入3-5 mL 20%乙醇，取下柱上面的接头看是不是往外流液体，因为注射器内有压力，液体会倒流，盖子内滴满液体，立即拧上盖子，防止进气泡，将进样阀的线接到检测器上。12.关闭系统：点击 End 关闭系统界面，关闭AKTA pure 电源，关电脑。2018-09-01AKTA pure 操作说明离子交换蛋白纯化步骤（RESOURCE Q/S ）1. 开机：打开 AKTA pure

9、 开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2. 打开系统：打开电脑：双击 Unicorn 7.0 打开系统 ,进入 log on 界面，用户名默认为 Default, 输入密码： default,点 ok 键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面： System Control 界面 , Evaluation 界面和 Administration 界面。其中 system Control 界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成： Manual-Execute Manual instructions-. ； Evaluation 界面为结果数据

10、查看及处理窗口； Administration 界面为 Unicorn 7.0 系统设置界面。3. 洗泵：点击 pause暂停系统 - 去离子水冲洗A1,B1 进液泵头 - 分别放入A ， B 液中；洗 B 泵：选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump洗 A 泵： 选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-PumpA wash- 点开 inlet, 选择 A1-Excuse, 洗泵结束后调B 至 100%，0min-Exe

11、cute 。4. 设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置最高柱压-Execute 。设流速： Pumps-System flow- 设置 system flow （1 mL/min ） -execute；注意： 流速和柱压设置参照“GE 蛋白纯化柱表” ，不要超出最高限制。5. 安装 RESOURCE 柱（先上后下）：装离子柱时先拧开离子柱上面， 连上来自进样阀的线， 边拧紧上面边拧松柱下面， 在离子柱子下端出口连上转接头， 接上一根较短的先并连到检测器上 （流出液体， 滴满检测器上的连接口的洞里，再拧紧） 。6. 平衡 RE

12、SOURCE 柱：等 B 液平衡后， 点击 Pumps-gradient-Target- 调 B 至 0%，0min-Execute 。等平衡后，记录最高和最低盐离子浓度：离子交换 B 液盐离子浓度约为 84%，离子交换 A 液盐离子浓度约为 1.7%。7.设置系统及收集参数：命 名：先 end-Manual instructions ，点击 browse，弹出 select result name&location 界面，点开文件夹“ defaultHome ”，找到文件夹“ labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹 (已创建 )，在界面下方“ name”指令框进行命名。注意：

13、命名时要标明日期，柱子型号 ，样品名称 。设流速： Pumps-System flow- 设流速（ 1 mL/min ） -Execute;设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -点击 Execute；紫外调零： Monitors-Auto zero UV-Execute；设置收集体积：Fracton collection-peakfractionation-fractionsize- 设置收集体积-Execute；一般设为1 mL (可根据实际情况调整) 。设置收集水平：Fracton collection-peak fractio

14、nation parameters-Start level-设置起始收集水平 - Execute 。注意： 对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，如 10 mAU ，避免损失蛋白。8.上样：冲洗 Loop 环：取 5 mL 注射器，吸取5 mL 分子筛（不能有气泡） ，从进样口注射2 倍Loop 体积的分子筛来清洗Loop 环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（ 2 mL ），12000 rpm 离心 3 min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop 环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出

15、注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop 环中。Inject: 点击 Flow path-injectionvalve- 点开 position 选项 -inject-execute- 走 2 倍Loop 体积的分子筛缓冲液；Load: 等流穿峰出来后，点击Flow path-injectionvalve- 点开 position 选项 -manualload-Execute ，调回 Load 状态。注意： 流穿峰蛋白先别丢弃，它有可能是样品没有挂上柱子而直接流出来的目标蛋白。9. 洗脱目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% ， length 50 min ( 可调 )-Execute ，自离子柱上洗脱结合的蛋白10. 收集目标蛋白：收集洗脱下来的蛋白样品，做好标记，过完后，peak fracstop 900 停止收集。11. B 液平衡离子柱：Pumps-Gradient target 50% ， length 0 min- Execute ，至盐离子浓度达到最高且平衡。如继续纯化其他蛋白样品：要用 A 液再平衡后再上样，步骤同上1-11。如不再纯化其他蛋白样品：点击 pause 暂停系统 -去离子水冲洗