PAS型流式细胞仪介绍

1、PAS型流式细胞仪介绍PAS流式分析系统全球顶级的全自动流式细胞仪PAS是一台用于单个细胞及微生物等各种颗粒分析的经典全自动流式细胞仪。 高效的荧光测量灵敏度：100MESF 低CV值，高精确度：CV1 超宽的样本颗粒检测范围：0.2200um 高效的检测过程：速度30000个颗粒/秒概述PAS流式细胞仪（PAS flow cytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技

2、术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。它具有如下几个特点：（1）标本只要是单细胞即可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析，因此，实际上所有组织细胞均可用于分析。（2）极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，最高每秒可测数万个细胞，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。（3）可同时分析单个细胞的多种特征，多参数相关测量，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多

3、种信息，使细胞亚群的识别、计数等更为准确。（4）定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。（5）统计学意义明显。 （6）分选对细胞群体的各亚群进行分类收集。光源配置可选择多种标准配置激光光源，如：20mW-100mW 功率的氩离子激光，100mW功率的紫外光源UV，25mW红色二极管激光，及其他固相激光。1-8个光学参数，齐全的光学配置是常规细胞分析、微生物分析、以至6色荧光免疫分型、精确的细胞绝对计数、DNA分析的前提必备条件。目前流式细胞仪发展的最新趋势是拥有极高的灵敏度和精确度（以DAPI染色DNA

4、或者与Hoechst同时标记细胞表面标志物），全血（非溶血）免疫分型技术，等等，这些先进的技术均可在PAS上得到体现。另外，PAS还拥有强大的光源扩展能力，用户还客根据科研的需要选择更广泛的外设激光光源，如：NdYAG、HeCd或HeNe激光等，可以满足科研的广泛需求。八个全关联光学参数，每一个都拥有自己的光电倍增管（PMT）,包括前向角光电倍增管。丰富的荧光参数为用户提供了广阔的选择空间、最佳的荧光灵敏度、完全满足未来临床多色荧光分析技术发展的未来趋势。PAS配置有内置奔腾处理器计算机及Windows XP操作界面，根据用户需要可选配Robby全自动样本制备器、全自动进样器，为全自动离人系统

5、及联网提供了可行性基础。PAS可直接将实验室资料、患者资料通过条码扫描仪整合至仪器内，并自动将结果以Word、Excel形式报告并将其通过网络传输至相应地点。流动室流动室(Cytometer)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，确保颗粒通过激光、紫外光照射可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流稳定流动，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞光学信息。样本泵的流速可在0-50ul/s范围内调节，鞘流压力可在0-500mbar范围内

6、连续调节。无论是鞘液还是废液均有液位感受器。在流动室的设计上Partec公司拥有30年以上的经验，确保液路在流动室内可达到毫微米级的精度。由于高精度的光源以及流动室的物理精度，可以保证每个参数的高精度结果，如：DAPI染色时CV值可达到1%，肿瘤分析及染色体分析同样可得到高灵敏度，互染率0.1%。而且本系统可以长时间绝对计数，在样本分析启动之后数秒钟即可显示浓度结果。光学系统提供全套光学滤片，可根据使用者的试验要求自由更换滤片。PAS系统可以提供前向角及侧向角信号以及6个荧光信号，本系统可选用所有常用的荧光素，如：FITC、GFP、PI、PE、PE-CY5、SR、APC、FDA、DAPI以及H

7、oechst。在标准配置中，PAS可以两个独立波长的激发光进行分析，如：紫外光+激光、二极管激光+氩离子激光、紫外光+二极管激光，无论是常规试验还是科研领域，高效的性能及完备的配置都为您的需求提供了保证。真正的测定体积的绝对计数独家专利技术PAS采用真正的测定体积的绝对计数分析所有的颗粒的分布浓度。此方法仅仅是基于颗粒浓度c、固定体积V内颗粒的数量N（C=N/V）的基础定义。体积是通过机械方式进行测量的，而不是通过有一定浓度的昂贵的beads进行校准。通过固定的机械设计定义测量体积的精密度，减少任何与beads浓度变化相关的误差。PAS测定允许分析的固定体积是在已给定直径2r的样品管内两个铂电

8、极之间的距离d或者控制样品速度的体积。此方法的好处：（4点）1 机械设计的数字化体积的精密度：优于的98%重复性，95%的精密度。2 无与校正物相关的误差。3 无需参考beads（无需内标），无需额外的准备时间。4 可免去校正beads的费用。软件软件介绍Windows FloMax 软件通过一个单独的软件包控制仪器，包括细胞获取，细胞分选以及在线和离线的数据分析。样品的准备可据仪器设定以及不同要求之间的转换自动进行。FloMax适用于微生物分析，免疫分型，细胞周期，DNA倍体以及流式细胞的科研分析。储存的数据通常是以原始数据且是以FCS流式细胞计数标准文件的格式进行储存，容易与其他分析软件进

9、行交流。同时分析不同的染料时，可对在线和离线时荧光光谱交迭色度亮度干扰进行补偿。N-color补偿运算规则对任何参数之间的色度亮度干扰进行校正时不需要复检标本。FloMax可最佳的支持PAS的测定体积的绝对计数特征，显示细胞内任何颗粒的浓度，甚至可在获取细胞之后通过门来定义。FloMax板块系统可根据不同的染料或仪器设置自动对标本系列重复进行自动化分析。FloMax报告系统是基于Visual Basic以Word或Excel格式产生的易于接受的报告。该软件主要特点如下： 采用全网络支持的Windows XP操作系统-Apple/Macintosh网络连接32位，标配Windows FloMax

10、软件，可用于临床及科研应用。 18参数实时获取及分析。 双波长的激发光进行time-window delay-system分析。 具备双精度的内部浮点运算。 1P直方图分辨率为64-32768道。 2P直方图分辨率为32/32-1024/1024道。 多参数门设置。 比率计算。 根据脉冲高度、面积、宽度进行双重计算。 峰、簇计算。 Robby全自动样本制备器、全自动进样器控制。 DNA细胞周期分析。 DNA峰分析。 多面板分析系统、自动获取。 FCS2.0流式标准软件用于原始数据及分析数据存储。 门及设置存储。 结果数据、图形、统计、仪器设置通过Word、Excel、desktop publi

11、shing systems、laboratory(LIS)软件处理。控制系统每个光学通道安装一个独立的脉冲分析控制处理器，是为了在平行脉冲处理过程中减少由于同时发生和死时间效应造成的信号丢失。6-decade范围制定的对数放大器为4-decade操作提供了可靠的动力学。每个参数16位（65536通道）的类似情况与数字之间的转换是基于色度亮度干扰补偿法则和其他的数字操作，例如：没经过处理时荧光比率测量。奔腾处理器进行信号分析，处理并实时的显示颗粒产生的变化，同时提供32位Windows操作系统的便利。实时性是测定体积的绝对计数准确性和基于复杂的软件门上进行高速度、高纯度分选的前提条件。PAS安装

12、了一个650MB CD-Writer和以太网卡，以便于储存数据及与internet网络连接， 10MB/S和100MB/S的速度利于连接实验室的信息系统（LIS）。PAS所开展的常用临床/科研项目及意义常用临床/科研项目及意义概述项目指标细胞亚群淋巴细胞亚群分析CD19+B淋巴细胞CD3+总T细胞CD3+ /CD4+T辅助/诱导细胞亚群CD3+ /CD8+T抑制/细胞毒细胞亚群CD3+ /CD8+/CD28+T细胞毒细胞亚群CD3+ /CD8+/CD28-T抑制细胞亚群CD3+ /CD4+/CD29+辅助细胞诱导亚群CD3+ /CD4+/CD45RA+抑制/诱导细胞亚群NK细胞CD3- /CD

13、16+56+NK细胞活化T细胞Cd25,CD69,HLA-DR白血病分型CD2,CD3,CD7T系CD19,CD10,CD22B系CD13,CD14,CD33髓系CD41,CD61,CD42b巨核系HLA-DR,TdT非系列特异性造血干细胞移植CD34+干祖细胞标志肿瘤DNA倍体分析DNA周期肿瘤预后、恶性程度、药物敏感肿瘤基因表达P53肿瘤基因表达与癌症的发生、预后的相关性多药耐药检测MDRMDR高表达显示病人对所有化疗药物的耐药移植免疫T细胞亚群及活化T细胞移植后排异及感染检测CD3，IgG移植前淋巴毒实验黏附分子CD11b，CD18粒细胞吞噬能力与感染控制CD44变异型肿瘤转移与侵润变态

14、反应性疾病相关性CD19+/CD23+高表达与哮喘发生及其严重程度相关自身免疫性疾病相关性HLA-B27/HLA-B7强直型脊柱炎血小板功能CD42a,CD42b缺乏时为巨血小板综合症CD41,CD61缺乏时为血小板无力症活化血小板CD62p,CD63血栓,心脑血管疾病、糖尿病伴微血管病变细胞增殖能力PCNA，Ki67，Cyclin系列药敏，细胞动力学研究细胞凋亡CD95CD95LAPO2.7ANNEXIN VBcl2其他HLA-DRMHC II类分子共同抗原CD45白细胞共同抗原CD55,CD59阵发性睡眠性血红蛋白尿细胞分泌功能各类胞浆内细胞因子PAS常用项目的主要临床/科研意义及标本来源

15、肿瘤学1DNA倍体分析: 检测指标：DNA 临床意义：DNA倍体分析用于肿瘤早期诊断、良恶性肿瘤判断、肿瘤预后、放化疗最佳治疗方案的选择，以及细胞凋亡检测。如正常组织和良性肿瘤DNA均为二倍体，DI（DNA指数）为1.0；恶性肿瘤时则出现异倍体，DI不等于1.0。 标本来源：抗凝全血、骨髓（0.5-1ml）；胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液(2x106细胞)；穿刺物、活检组织、各种实体组织（0.1cm3以上）。2多药耐药性（MDR） 检测指标：p-gp（膜结合糖蛋白）。 临床意义：例如，白血病化疗失败的主要原因是白血病细胞对化疗药物产生多药耐药性（MDR），用流式细胞技术监测MDR基因编码的膜

16、结合糖蛋白（P-gp）有助于判断白血病患者预后，指导临床化疗方案的设计。 标本来源：抗凝全血、骨髓（0.5-1ml）；胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液(2x106细胞)；穿刺物、活检组织、各种实体组织（0.1cm3以上）。3肿瘤相关蛋白 检测指标：P53蛋白 临床意义：P53基因是一种重要的抑癌基因，其编码的p53蛋白有监控细胞DNA损伤，诱导细胞凋亡的作用。突变的p53则与肿瘤的发生、发展有密切的关系，其中包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、膀胱癌、软组织肿瘤、血液性肿瘤等。 标本来源：抗凝全血、骨髓（0.5-1ml）；胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液(2x106细胞)；穿刺物、活检组织、各种

17、实体组织（0.1cm3以上）。细胞凋亡 Fas/FasL：Fas和FasL是一对介导细胞凋亡的细胞表面分子，这两种标志的检测常用于抗肿瘤、抗病毒和抗感染等的研究。 Bcl-2：Bcl-2和P53的作用相反，是抑制细胞凋亡的因素。 Annexin V、 Apo2.7、Caspase：早期细胞凋亡时，细胞的某些特性会发生改变。如墨磷酯酰丝氨酸（PS）由膜内转向膜外（用Annexin V检测）；线粒体膜出现Apo2.7蛋白；细胞内半胱氨酸蛋白酶（Cas-pase）的激活等。 标本来源：抗凝全血、骨髓（0.5-1ml）；胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液(2x106细胞)；穿刺物、活检组织、各种实体组织

18、（0.1cm3以上）。血小板1血小板功能缺陷 检测指标：CD41（GPIIb）、CD61（GPIIIa）、CD42a（GPIX）、CD42b（GPIb） 临床意义:先天性血小板功能缺陷，如血小板无力症和巨大血小板症均存在特定膜糖蛋白异常的现象，前者缺乏CD41和CD61，后者缺乏CD42a和CD42b。 标本来源：抗凝全血（0.5-1ml）、富血小板血浆（PRP）。2血小板活化 检测指标：CD62p、CD63 临床意义：近几年研究表明，血小板的活化与血栓形成、动脉粥样硬化、炎性反应、周围血管疾病等密切相关。用流式细胞仪检测表达于血小板表面的颗粒膜蛋白CD62p（GMP140）和CD63，可以特异地评价血小板活化程度。 标本来源：抗凝全血（0.5-1ml）、富血小板血浆（PRP）。网织红细胞计数 检测指标：RNA 临床意义：网织红细胞（Reticulocyte，Ret）计数是判断骨髓红细胞系统造血情况的重要指标。传统的Ret计数采用煌焦油蓝目视计数，方法虽简单，但主观因素影响大，准确性和重复性差，用流式细胞术检测Ret内RNA特异性结合的荧光强度，可精确地表示Ret在成熟红细胞中的比值，从而敏锐地反映骨髓红细胞生成的早期变化，具快速、计数细胞量大、准确性好和