谷氨酸分子印迹电化学传感器的研究 Microsoft W

1、谷氨酸分子印迹电化学传感器的研究赵硕1，崔莉凤2，申晴2（1河北联合大学轻工学院，河北唐山 063000；2北京工商大学食品学院，北京 100048）摘要: 以谷氨酸为模板，邻氨基酚为功能单体，铁氰化钾为印迹电极和底液间的探针，利用循环伏安法成功制备了谷氨酸分子印迹聚合物传感器。并优化了其反应条件（pH=5.5，T=20，单体：模板= 2.2:1，聚合时间25圈，洗脱时间=2min，洗脱材料：硫酸）。制备的谷氨酸分子印迹电化学传感器的相对标准偏差分别为2.91%3.39%。线性范围0.5mmol/L3.0mmol/L。对实际样品进行检测，其加标回收率为87110%。连续洗脱32次之后电极衰减到

2、30%以上。与其他方法进行比较，本方法有检测灵敏度高，抗干扰能力强等优点。关键词：分子印迹；电聚合；谷氨酸；邻氨基酚Glutamate electrochemical sensors based on molecularly imprinted polymersAbstract : taking glutamic acid as template, Ortho-aminophenol as functional monomer, K3Fe(CN)6 for imprinting electrode and bottom of liquid probe, Using cyclic voltamm

3、etry method prepared glutamic acid molecularly imprinted polymer sensors. And optimization of the reaction condition（pH=5.5，T=20，imprinting time:25 circles, the elution time is 2min，the elution material:sulfur）. The Glutamic Acid Molecularly Imprinted Electrochemical sensor relative standard deviati

4、ons is 2.91% 3.39%. The linear range from 0.5mmol / L to 3.0mmol / L. The actual samples tested, and the recovery is 87-110%. after Continuous elution electrode 32 times, the attenuation to more than 30%. Detection of glutamate and other methods, this method has good sensitivity strong anti-interfer

5、ence ability.Key words: Molecular imprinting technology; electropolymerization; glutamate; O-aminophenol L-谷氨酸在食品、医药、日化工业等方面都有重要的用途1。旋光法对环境和设备的状态要求较高，有任何一点不满足要求就可能产生误差2。谷氨酸中含有微量的其他成分也会对检测结果产生影响。采用液相色谱法所需设备价格昂贵。国内外高效液相色谱法(HPLC)测定谷氨酸的色谱方法多为用邻苯二甲醛在催化剂作用下与氨基酸发生衍生化反应，衍生物经HPLC分离后用电化学检测或荧光检测器检测测定含量3，这种方法的缺

6、点就是分析时间长、成本高。还有一种常用的氨基酸定量分析方法主要有纸层析-茚三酮显色法方法，存在着分离效果差、灵敏度低的弊端。分子印迹技术(molecularly imprinting technology,MIT)是指制备对某一特定的目标分子具有特异选择性的聚合物的过程，它模拟了生物界的钥匙与锁的原理4。其原理是在交联剂的存在下功能单体围绕着模板分子或印迹分子进行聚合，聚合完成以后移去共价键或非共价键结合的模板分子，得到具有特别识别孔穴的三维网状结构的聚合物，即分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymers，MIPs)5。由于MIPs具有高度交联的结构，稳定性好，能

7、够在高温、高压、有机溶剂、酸、碱等苛刻环境中使用，而且造价低廉，在手性化合物的分离6、固相萃取7,8、药物临床分析9,10、分离11,12、仿生传感器13,14北京市自然科学基金（项目编号：2102015）资助。环境监测15等领域得到了日益广泛的应用，展现出较好的前景。分子印迹电化学传感器因为其具有制备简单和能够获得重现性优良的超薄膜等优点而越来越受到大家的重视。1.材料与方法1.1 仪器与试剂AUT070416型电化学工作站（瑞士万通中国有限公司）；金电极为工作电极（=3mm）、铂电极为对电极和饱和甘汞电极为参比电极（江苏金坛电分析仪器厂）。谷氨酸标准样品AR（北京化工厂）；邻氨基酚AR（北

8、京理工大学科技开发公司），铁氰化钾AR(北京化工厂）；其余试剂均为分析纯。1.2 金电极的处理金电极在0.3m的A12O3粉末上打磨，直至出现光滑的镜面。用去离子水超声洗涤5min.。然后在K3Fe(CN)6中 -0.1 0.6V进行循环伏安法（CV）扫描直至达到稳定。1.3 分子印迹传感器敏感膜的制备金电极为工作电极，邻氨基酚为功能单体，用0.1moL/L的HClO4溶解，用0.4moL/L的NaOH调节pH值5.5，加入谷氨酸0.05g。用CV法电位为-0.21.2V，平衡时间为10s.范围内扫描25圈，扫描速度为50mv/s。聚合膜沉积在电极的表面，用1.0 mol/L H2SO4溶液进

9、行超声洗脱2min，将模板分子从电极上除去，制成留有模板分子构型空穴的分子印迹高分子印迹聚合物薄膜。在同样条件下，与未加模板分子谷氨酸时制备的非印迹膜电极进行比较。1.4 谷氨酸的检测采用三电极装置：印迹分子传感器为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。在室温条件下，将印迹电极浸入到5.0mmol/L K3Fe(CN)6溶液中，当背景电流达到稳定后，加入谷氨酸溶液。采用循环伏安法对印迹传感器进行电化学表征。以示差脉冲法对谷氨酸印迹传感器的分子印迹效应进行定量计算。2.结果与讨论2.1 分子印迹电聚合过程经过预处理的金电极即裸电极的对铁氰化钾标准溶液循环伏安响应曲线如图1所示。由图中

10、可以看出，有氧化还原峰，形状很准确，可逆性好，证明该金电极可以正常工作。在电极印迹过程中，由于电极表面经过预处理没有任何附着物，所以会出现较高的峰电流a；然后随着聚合物被逐渐印迹在电极表面b；氧化峰和还原峰逐渐消失并且每一圈的趋势是比上一圈峰电流更低。邻氨基酚在金电极上的电化学聚合是一个完全不可逆的过程。生成的非导电聚合膜是电流逐圈减少的原因。聚合过程结束时，电极上已经印迹了一层肉眼难辨但是结实致密的分子印迹膜，这层膜不导电。聚合结果如图2所示。图1金电极的循环伏安响应曲线Fig.1gold electrode pole cyclic voltammetry graph图2印迹电极的循环伏安曲

11、线图(a为电聚合第一圈，b为余下的圈数)Fig.2 The molecularly imprinted polymer electrode cyclic voltammetry graph (for a:the first circle,没有模板分子印迹后洗脱模板分子的聚合膜在电子显微镜下的形态，可以通过图3看出，这层致密的膜结构，与图4的有印迹模版洗脱后形成的空穴形成了鲜明的对比。 图3无模板分子洗脱后电镜图 图4有印迹模板洗脱后电镜图Fig.3 the EMS of Excluding imprinting molecule elutioned Fig.4 the EMS of Conta

12、in imprinting molecule elutioned2.2印迹分子膜电极的电化学性能2.2.1聚合结果的比较裸电极、有印迹分子聚合后、有印迹分子洗脱后、无印迹分子聚合后的示差脉冲曲线如图5所示。从图中可以看出，裸电极的表面光滑，导电性能最好，所以峰电流a最高；其次是印迹分子聚合洗脱之后的电极c，因为洗脱后电极上原来的印迹分子脱落留下空穴，使得原来致密的聚合膜结构发生改变，电极能够和溶液接触到，空穴部分导电性能增强；b和d是有印迹分子和没有印迹分子聚合后的示差脉冲曲线，由于印迹后的电极完全被聚合膜覆盖，导电性几乎为零。图5电极的示差脉冲曲线(a)裸电极；(b)含印迹分子印迹后；(c)

13、含印迹分子洗脱后；(d)不含印迹分子Fig.5 Differential pulse curve of the electrode(a) Naked electrode; (b)Including molecularly imprinted molecularly imprinted electrode; (c)Contain imprinting molecule elutioned electrode; (d) Excluding imprinting molecule electrode2.3聚合过程的条件优化2.3.1 pH条件实验结果及分析溶液pH的优化有助于反应中聚合膜的形成，当p

14、H在中性和碱性溶液中得到无活性膜,只有在酸性溶液中才能得到活性均匀的膜16，本实验在较酸性条件下分别选取了pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5对比对印迹膜的影响结果，印迹后峰电流最低的是pH为5.5的条件下聚合的，印迹后的峰电流越低说明膜越结实致密，也就是印迹的越好，所以pH5.5这个条件下印迹的聚合膜是最好的。洗脱后峰电流最高的是pH5.5，峰电流高说明洗掉的空穴越多，空穴部分是可以导电的，相应的电流就会越高。洗去的谷氨酸印迹分子越多，就更有利于在应用中对低浓度谷氨酸分子的检测。所以pH5.5又是最好的洗脱条件。从图6中可以非常直观的看出pH5.5是最佳聚合条件。 图6 pH 值优化

15、曲线图 Fig.6 pH optimize curve2.3.2 温度条件实验结果及分析温度对膜的形成有一定的影响。温度过高，会对形成的膜进行破坏，而温度过低则很难生成聚合物膜，所以应找到最佳的聚合温度。本文分别在15，18，20，22，25条件下做温度的条件实验，在洗脱2分钟后，峰面积最高的是20，并且峰面积远远大于其他几个条件，说明这个温度下洗脱下的印迹分子很多，出现了很多空穴。图7可以明显的看出温度对实验结果的影响。可以看出20为最佳温度。图7温度值优化曲线图Fig.7temperature optimize curve2.3.3单体量的条件优化单体邻氨基酚与模板谷氨酸的使用量应有一定的

16、比例，单体量过少，单体间不能充分的聚合，单体量过大，会出现印迹分子的包埋现象，所以应控制单体与模版的比例。单体量邻氨基酚与模板的投入量比例分别为1.4:1，1.8:1，2.2:1，2.6:1，3.8:1。从图8可以看出，单体与模板的比例为2.2:1时为最佳。 图8模板、单体优化曲线图Fig.8 template、 melamine concentration optimization curve2.3.4聚合时间的分析聚合时间对形成膜有很大的影响。过少圈数的扫描可能会导致印迹不够完全，过多的圈数没有太大的实际意义。聚合时间分别取20圈，25圈，30圈，35圈。通过分析可以得出这样的结论，聚合2

17、5圈之后的膜质量更好，洗出的空穴更多，20圈的峰电流低是因为聚合时间过短，印迹分子没有更好的聚合在膜上，能够被洗脱掉成为空穴的部分就越少，电流响应就弱。而30圈和35圈洗脱后电流与25圈相比没有增加，所以25圈是聚合洗脱的最佳条件。结果如图9所示。图9 聚合时间优化曲线图Fig.9 Electropoly time concentration optimization curve2.3.5洗脱时间条件实验结果及分析洗脱时间分别选取：1 min，2 min，3 min，4 min。洗脱采用盐酸在超声振荡仪中震荡不同的时间来实现洗脱时间的条件实验。图10是洗脱时间条件实验的结果，2min是最佳条件

18、，比1min高出很多，印迹效果明显。之后的3min和4min已经保持不变了，没有印迹分子能够被洗脱下来。所以2min是最佳洗脱条件。图10 洗脱时间优化曲线图Fig.10 The optimal elution time graph2.3.6洗脱材料条件实验结果及分析分别选择了五种性质各异的酸：盐酸，硝酸，硫酸，磷酸，醋酸配成相同浓度1mol/L，分别作为洗脱材料进行聚合后的洗脱，通过结果的比较找出洗脱效果最好的材料。图11是洗脱材料条件实验结果的比较，分析这个结果，得到最佳洗脱材料为硫酸，因为硫酸既是强酸又是二元酸，在酸浓度相同的前提下，二元强酸的氢离子浓度是一元强酸的两倍，这就是硫酸比盐酸

19、和硝酸洗脱效果好的原因。而硝酸和盐酸同为一元强酸，但是硝酸无论浓稀都有氧化性，所以硝酸又比盐酸的洗脱能力强，而磷酸虽然是三元酸，但它不是强酸，氢离子只能部分电离，所以酸性不是很强。醋酸是很弱的酸，配成溶液又要经过稀释过程，就更加减弱了的它的洗脱性能，所以效果最差。洗脱过程中一般不采用中强酸或弱酸进行洗脱。图11 洗脱材料优化曲线图Fig.11 The optimal elution material graph2.3.7有无氮气条件实验结果及分析实验操作是在印迹开始前先充入氮气，待溶液液面到烧杯口胶塞处充满氮气后停止充氮，这样就能保证在聚合过程中溶液受到氮气保护，因为氮气比空气重，所以会一直沉

20、积在烧杯中，不会由于密度轻而从烧杯中浮出来。实验得出的结论是充氮气比较利于洗脱。因为空气会对反应过程产生干扰，而氮气在一般实验条件下不会与其他物质发生反应，是保护性气体。印迹后充入氮气的峰电流较低，说明充氮气的条件下聚合膜质量比较好，所以充入氮气的条件利于聚合；洗脱后充氮气的峰电流较高，得到的空穴多，说明充入氮气也利于洗脱；综合来讲就是充氮气比较适合分子印迹膜的制备。2.4 谷氨酸分子印迹电化学传感器的性能指标2.4.1线性范围利用制备好的电极测定一系列谷氨酸的不同浓度的溶液与仪器响应之间的函数关系。 分别测量含有0.5m mol/L，1.0mmol/L，1.5mmol/L，2.5mmol/L

21、，3.0mmol/L谷氨酸溶液2.0ml的铁氰化钾标准溶液，通过示差脉冲曲线得出峰电流，记录峰电流的变化。谷氨酸浓度与电化学响应在0.5mmol/L3.0mmol/L范围内呈线性关系。相关系数为R2=0.9989。如图12所示。图12标准工作曲线图Fig.12 The Standard working curve2.4.2准确度和精密度用最佳实验条件下制备的印迹膜电极（检测浓度为0.810-3mol/L 和2.010-3mol/L）检测相同浓度的谷氨酸（n=5），计算结果表明相对标准偏差分别为3.39%和2.91%。如表1所示。表1谷氨酸检测重复实验数据Table1 glutamic repe

22、ated testing experiment data平行实验次数对应浓度10-3mol/L相对标准偏差RSD%对应浓度10-3mol/L相对标准偏差RSD%10.823.392.022.9120.811.9730.761.9540.792.0150.741.98分别检测味精和鸡精待测液中谷氨酸的含量，进行比较。采用加标回收的方法对不同种类的实际含谷氨酸样品进行检测，测定结果见表2 。其加标回收率分别为87104%和92110%。表2样品加标回收率实验结果（1）Table2 the prevented recovery of experimental data（1）平行实验次数加标样品测定值

23、/g/ml样品测定值/g/ml加标量/g/ml回收率/%18.816.73210428.466.5429638.386.63287.548.316.22210458.096.35287表3样品加标回收率实验结果（2）Table3 the prevented recovery of experimental data（2）平行实验次数加标样品测定值/g/ml样品测定值/g/ml加标量/g/ml回收率/%14.833.02290.525.012.96210235.333.13211045.123.2829254.942.8421052.4.3使用寿命用连续洗脱的方法进行使用寿命的实验，采用示差脉冲

24、法进行检测，当到了第32次峰电流突然明显增强，这是由于分子印迹膜在多次洗脱后到达损坏极限，电极上的印迹膜已经不能再使用。此电极的使用寿命为31次。3 结论本实验在以邻氨基酚为功能单体，以谷氨酸为模板，成功制备了谷氨酸分子印迹电化学传感器，并优化了其反应条件。用此电化学传感器测量味精和鸡精中谷氨酸的含量。该方法在0.5mmol/L3.0mmol/L范围内呈良好的线性关系，并且选择性好，灵敏度高，操作简便，为连续检测谷氨酸提供了一种新的方法。参考文献1李华清，郭宗慧，刘春秀等.基于氧化还原聚合物固定双酶的谷氨酸传感器的研究J.分析化学，2006，34:14.2 吴延陵，周跃，对用甜菜废糖蜜发酵生产

25、的L一谷氨酸旋光法测定含量问题的初探, 发酵科技通讯1983，12（3）3 谭力，刘放南，张旭松，人胃粘膜中2氨基丁酸和谷氨酸含量的高效液相色谱法测定A，色谱，2004，22， 1311334王斌，王榕妹，王俊卿等.分子印迹材料研究进展J.化学研究与应用，2010，22(2):1291355白杨.分子印迹聚合物简介及研究进展J.江西蓝天学院学报，2007，2(2):2528.6Frances co Puocietc. New restrict tedaccess materials combined to molecularly imprinted polymers for selective recognition /releasein water mediaJ.Science Direct，2009，45：1634-16407Z.Sunetc.Selective trace analysis of diclofenacin surface and waste water sample