第六章 发酵液预处理及固液分离

1、第六章发酵液的预处理及第六章发酵液的预处理及固液分离固液分离四川理工生药2011抗生素下游加工的一般过程抗生素下游加工的一般过程1、发酵液的预处理和固液分离、发酵液的预处理和固液分离2、提取：沉淀、吸附、萃取、提取：沉淀、吸附、萃取3、分离（精制：层析、离子交换）、分离（精制：层析、离子交换）4、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）第一节发酵液的性质第一节发酵液的性质一、抗生素在发酵液中的存在部位一、抗生素在发酵液中的存在部位存在部位存在部位.细胞内：积累于菌丝体内，且水细胞内：积累于菌丝体内，且水溶性小（少数）溶性小（少数）.细胞外：产生后被分泌到细

2、胞外细胞外：产生后被分泌到细胞外（多数）（多数）胞内抗生素：胞内抗生素：过滤过滤 滤饼滤饼提取提取加酸、碱等使其转入细胞外加酸、碱等使其转入细胞外二、抗生素的稳定性二、抗生素的稳定性抗生素需在适宜的温度、抗生素需在适宜的温度、pH值、压力等值、压力等条件下才稳定。提取、分离等过程应提供适条件下才稳定。提取、分离等过程应提供适宜的条件。宜的条件。eg.青霉素青霉素 pH值值4.8-5.2，低温条件下，低温条件下才稳定才稳定三、发酵液中的杂质三、发酵液中的杂质较多包括：较多包括：.可溶性：可溶性：Pr. aa. 金属离子等金属离子等萃取，分离，离子交换萃取，分离，离子交换.不溶性：菌丝体、剩余培养

3、基等不溶性：菌丝体、剩余培养基等过滤除去过滤除去第二节发酵液预处理的方法第二节发酵液预处理的方法一、发酵液预处理的目的一、发酵液预处理的目的、固液分离：分离菌丝体、未用完培养基及其它、固液分离：分离菌丝体、未用完培养基及其它代谢产物等，尽可能使发酵产物转入后续工序处代谢产物等，尽可能使发酵产物转入后续工序处理的相中（多为液相）理的相中（多为液相）、能够除去部分杂质：主要去除蛋白质和金属离、能够除去部分杂质：主要去除蛋白质和金属离子，减少后续处理的负荷。子，减少后续处理的负荷。二、二、发酵液预处理的要求发酵液预处理的要求1、菌体分离、菌体分离 发酵液中除发酵产物外，还含有大量的菌体，发酵液中除发

4、酵产物外，还含有大量的菌体，为方便提取和精制，首先要将菌体与发酵液分为方便提取和精制，首先要将菌体与发酵液分离。离。 为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制发为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制发酵终点。否则对目标物的回收均不利。酵终点。否则对目标物的回收均不利。、蛋白质的去除、蛋白质的去除 发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一些发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一些可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去除。可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去除。 除去蛋白质的滤液要保证在一定的除去蛋白质的滤液要保证在一定的pH 范围范围内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离子交换内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离子交换提取

5、。提取。 、重金属离子的去除、重金属离子的去除 重金属离子的存在，会影响提取和精制，重金属离子的存在，会影响提取和精制，同时会影响发酵产物的质量和回收率，故必须同时会影响发酵产物的质量和回收率，故必须除去。除去。、色素、热原质、毒性物质的去除、色素、热原质、毒性物质的去除 针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。、改变发酵液性质，以利于提取和精制后续、改变发酵液性质，以利于提取和精制后续工序的操作顺利进行工序的操作顺利进行 如，当发酵终了时，发酵产物可能在发酵如，当发酵终了时，发酵产物可能在发酵液中，也可以在菌体内部或两相同时存在。液中，也可以在菌体内部或两

6、相同时存在。常采用调节常采用调节pH、酸性或碱性的方法使发酵产、酸性或碱性的方法使发酵产物转入后续处理的相中。物转入后续处理的相中。、调整适当、调整适当pH值和温度值和温度 避免引起产物的破坏和损失。多数抗生素避免引起产物的破坏和损失。多数抗生素不耐热，对不耐热，对pH值要求高。值要求高。三、蛋白质的预处理（除杂蛋白）三、蛋白质的预处理（除杂蛋白）1等电点沉淀等电点沉淀 2. 变性沉淀变性沉淀 3加各种沉淀剂沉淀加各种沉淀剂沉淀 4加入凝聚剂（金属盐）加入凝聚剂（金属盐） 5加入絮凝剂加入絮凝剂 1等电点沉淀等电点沉淀 调调Ph到等电点，杂蛋白的到等电点，杂蛋白的净电荷为零，溶解净电荷为零，溶

7、解度最小，沉淀析出。度最小，沉淀析出。多数抗生素发酵液的等电点多数抗生素发酵液的等电点4.0-5.5之间，之间，一般加酸调。如：硫酸、盐酸、磷酸等。一般加酸调。如：硫酸、盐酸、磷酸等。2. 变性沉淀（凝固）：变性沉淀（凝固）：加热，但多数抗生素不耐热，只适用于热稳定加热，但多数抗生素不耐热，只适用于热稳定抗生素。如：灰黄霉素抗生素。如：灰黄霉素加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等3加沉淀剂沉淀：加沉淀剂沉淀： n对酸性发酵液：可加阴离子，如三氯乙酸，对酸性发酵液：可加阴离子，如三氯乙酸，鞣酸等鞣酸等n对碱性发酵液：可加阳离子，如对碱性发酵液：可加阳离子，如A

8、g+、Cu2+、Zn2+等等4加入凝聚剂（金属盐）加入凝聚剂（金属盐） n凝集剂的作用：粒子表面电荷中和；消除凝集剂的作用：粒子表面电荷中和；消除粒子表面稳定的双电荷层；使胶体粒子的粒子表面稳定的双电荷层；使胶体粒子的排斥电位降低而发生聚沉。排斥电位降低而发生聚沉。n金属盐特别是重金属盐较常用。如，硫酸金属盐特别是重金属盐较常用。如，硫酸铝、三氯化铁等铝、三氯化铁等5加入絮凝剂加入絮凝剂 n絮凝絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程粗大絮凝团的过程。n近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、近年较常

9、用。如，壳聚糖、海藻酸钠、明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电荷密度高。荷密度高。5加入絮凝剂加入絮凝剂 n絮凝絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程粗大絮凝团的过程。n近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电荷密度高。荷密度高。四、高价金属离子的去除四、高价金属离子的去除Ca2+：加入草酸钠或草酸，生成的草酸钙沉淀还能促使加入草酸钠或草酸，生成的草酸钙沉淀还能促使杂蛋白质凝

10、固，提高滤速和滤液质量。杂蛋白质凝固，提高滤速和滤液质量。 Mg2+：草酸、草酸、 磷酸盐（在碱性条件下，生成磷酸镁盐沉磷酸盐（在碱性条件下，生成磷酸镁盐沉淀）、三聚磷酸钠。淀）、三聚磷酸钠。nFe3+：n加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀。第三节发酵液的液固分离第三节发酵液的液固分离一、固液分离的目的一、固液分离的目的n收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相（胞内抗生素）（胞内抗生素）n收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物如，细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物如，细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等

11、。和它们的絮凝体等。 （胞外抗生素）（胞外抗生素）二、固液分离的要求二、固液分离的要求n滤液澄清滤液澄清便于后续处理便于后续处理n速度快多数抗生素不稳定速度快多数抗生素不稳定三、影响固液分离的因素三、影响固液分离的因素、微生物的种类：、微生物的种类： 真菌：比较粗大真菌：比较粗大, ,易过滤分离易过滤分离, ,通常不需特殊处理通常不需特殊处理 放线菌放线菌: :细而分枝细而分枝(1um),(1um),较黏较黏, ,较难较难. .需处理需处理加加 助滤剂或蛋白絮凝剂助滤剂或蛋白絮凝剂 细菌细菌: :体积细小体积细小, ,过滤最难过滤最难, ,可考虑离心可考虑离心、菌体细胞、菌体细胞: :通常细胞

12、破碎或细胞自溶后粘度增大。通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大。因此细胞破碎的程度应控制，发酵放罐时间要适宜。因此细胞破碎的程度应控制，发酵放罐时间要适宜。3 3、培养基成分、培养基成分：如用黄豆粉、花生粉作氮源，淀粉作：如用黄豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都会升高。碳源，粘度都会升高。固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。固液分离越困难。四、固液分离常用方法：过滤和离心四、固液分离常用方法：过滤和离心 过滤：过滤：悬浮液通过过滤介质时固态颗粒与悬浮液通过过滤介质时固态颗粒与溶液分离。分为澄清过滤和滤饼过滤。溶液分离。分为澄清过滤和滤

13、饼过滤。 离心分离：离心分离：在离心力场的作用下，将悬浮在离心力场的作用下，将悬浮液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒较小的悬浮液和乳浊液的分离。较小的悬浮液和乳浊液的分离。 在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下。颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下。（一）过滤：（一）过滤：q过滤介质过滤介质filter medium:filter medium:过滤采用的多孔物质；过滤采用的多孔物质； q滤浆滤浆filter pulpfilter pulp: : 所处理的悬浮液；所处理的悬浮液； q滤

14、液滤液filtrate: filtrate: 通过多孔通道的液体；通过多孔通道的液体； q滤饼或滤渣滤饼或滤渣 filter cake:filter cake:被截留的固体物质。被截留的固体物质。 1）常规过滤：）常规过滤：n料液流动方向与过滤介质垂直。通常适于过滤直料液流动方向与过滤介质垂直。通常适于过滤直径较大的悬浮粒子。如放线菌、霉菌发酵液。径较大的悬浮粒子。如放线菌、霉菌发酵液。n 对细小菌体或黏度较大的发酵液，需使用助滤剂。对细小菌体或黏度较大的发酵液，需使用助滤剂。n当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。渐形成滤饼（

15、滤渣）。n在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用过滤作用n适合于固体含量大于适合于固体含量大于0.1%的悬浮液的过滤分离。的悬浮液的过滤分离。1、过滤分类、过滤分类 3）错流过滤：）错流过滤：n 又称切向流过滤又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）n 传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻 力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的 机制，即机制，即液体的流向和滤膜相切。液体的流向和滤膜相切。n 在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内在压

16、力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内 壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介 质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上 的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变 的过滤速度的过滤速度2 2、过滤介质选择、过滤介质选择n过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质：合理选择过滤介质：n过滤介质所能截留的固体粒子大小过滤介质所能截留的固体粒子大小：

17、通常以过：通常以过滤介质的滤介质的孔径孔径表示。常用的过滤介质中，纤维表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约滤布所能截留的最小粒子约10m10m，硅藻土为，硅藻土为lmlm，超滤膜可小于，超滤膜可小于0.5m0.5m。n发酵液中悬浮离子的大小发酵液中悬浮离子的大小n过滤介质的种类过滤介质的种类n1、织物介质、织物介质n2、粒状介质、粒状介质n3、多孔固体介质、多孔固体介质n4、微孔纤维素薄膜和金属薄膜介质、微孔纤维素薄膜和金属薄膜介质1）织物介质）织物介质 又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。纤维滤布和合成纤维滤

18、布。 其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是纤维的特性、编织纹法和线型纤维的特性、编织纹法和线型。2）粒状介质）粒状介质 有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质：最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质： 一般不与酸碱反应，化学性能稳定；一般不与酸碱反应，化学性能稳定； 形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；表面； 无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作压力变化。压力变化。3 3）多孔固

19、体介质）多孔固体介质 如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。 4 4）微孔纤维素薄膜和金属薄膜介质）微孔纤维素薄膜和金属薄膜介质典型过滤设备：典型过滤设备：按操作方式分类：间歇过滤机、连续按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机过滤机按操作压强差分类：压滤、吸滤和离按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤心过滤实验室用抽滤装置实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作）板框压滤机（间歇操作） 转筒真空过滤机（连续操作）转筒真空过滤机（连

20、续操作） 过滤式离心机过滤式离心机3 3、过滤设备、过滤设备1 1）实验室用抽滤装置）实验室用抽滤装置2 2）板框压滤机）板框压滤机plate and frame filterplate and frame filter 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。进料贮槽中的气压。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量适合于固体含量1-10%1-10%的悬浮液的分离。的悬浮液的分离。 33板框压滤机板框压滤机

21、 包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。的通道。优点优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。对不同过滤特性的发酵液适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过

22、降可以超过0.1MPa,0.1MPa,这是真空过滤器无法达到这是真空过滤器无法达到的。的。缺点缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。3 3）转筒真空过滤机）转筒真空过滤机 转筒真空过滤机是一转筒真空过滤机是一种应用较为广泛的连续操种应用较为广泛的连续操作过滤设备，其主体是一作过滤设备，其主体是一个能转动的水平圆筒，圆个能转动的水平圆筒，圆筒表面装有金属网，网上筒表面装有金属网，网上覆盖滤布，圆筒的下端浸覆盖滤布，圆筒的下端浸入滤浆。入滤浆。优点：优点： 转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再

23、生连转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小续化操作，生产能力大，劳动强度小缺点：缺点： 辅助设备多，投资大，辅助设备多，投资大， 且由于真空过滤，推动力小（不超过且由于真空过滤，推动力小（不超过8 8104 104 PaPa），滤饼湿度大（），滤饼湿度大（20203030）。）。 主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。差。39结构结构：转鼓转鼓滤饼滤饼滤布滤布滤网滤网离心过滤机工作原理图离心过滤机工作原理图p转鼓转鼓( (上有小孔，亦称

24、悬上有小孔，亦称悬框框) )； 滤网；滤网； 滤布；滤布； p机架。机架。 原理：原理： 由于离心力作用，液体产生径向压差，通过由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。滤饼、滤网及滤筐而流出。4）离心过滤机）离心过滤机（二）离心分离（二）离心分离优点：优点：分离速度快，分离速度快，分离效率高、分离效率高、液相澄清度好液相澄清度好缺点：缺点：设备投资高；设备投资高；能耗大；能耗大；离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。 通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分

25、含量较低的滤饼。或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。41按速度和离心力：按速度和离心力：1 1、常速离心机常速离心机 最大转速最大转速8000rpm(r/min),8000rpm(r/min),相对离心相对离心力力(RCF)10(RCF)104 4g g以下以下, ,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2 2、高速（冷冻）离心机高速（冷冻）离心机 1 110104 4-2.5-2.510104 4rpmrpm，相对，相对离心力离心力10104 410105 5g,g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；沉淀物等分离；3 3、超速离心机超速离心机 转速转速2.5-82.5-810104 4rpmrpm，相对离心力，相对离心力5 5* *10105 5g g；用于；用于DNADNA、RNARNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。离心机的种类与用途离心机的种类与用途按离心机的作用方式：按离心机的作用方式：q斜角式斜角式q平抛式平抛式q管式管式q蝶式蝶式q螺旋式螺旋式q多室多室431 1）斜角式离心机）斜角式离心机v是一类结构最简单的实验室常用是一