ABA综述性论文(2)

1、湖南农业大学课程论文学 院：生科院 专业年级：姓 名： 学 号：课程论文题目：植物激素脱落酸(ABA)课程名称：植物生长物质评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期：2015 年 12 月 27 日植物激素脱落酸(ABA) 摘 要：脱落酸(简称ABA)在植物生长发育过程中有着重要作用,同时也是一种应激激素,能够抵抗外界环境胁迫。植物一些发育过程如种子萌发、胚胎发育和果实成熟中,ABA含量会发生变化。近年来关于脱落酸在生物合成、代谢和信号转导等方面的研究已取得突破性进展。本文介绍高等植物ABA生物合成途径, ABA受体的研究, ABA信号转导通路模型的构建。关键词：脱落酸、应激激素、生物合成,

2、、信号转导脱落酸 (abscisic acid, ABA) 是 20 世纪 60 年代在植物体内发现的半萜类化合物，在植物生长和响应逆境过程中发挥着重要作用1。近年来在 ABA合成代谢和信号转导等方面的研究已取得突破性进展。ABA 生物合成和信号调节与一些关键酶及转录因子关系紧密，如细胞质内产生的 PYR/PYL/RCAR (PYLs) 蛋白作为 ABA 受体，有传递ABA 信号的作用.一、生物合成C4O间接途径是高等植物ABA生物合成的主要途径,其经过聚合、环化、异构化、氧化、裂解等复杂的反应,分为几个阶段(Seo,2002):(l)早期反应:在质体内类葫萝卜素前体胡萝卜素的形成;(2)中期

3、反应:在质体内由形成玉米黄质开始至9一顺紫黄质裂解的过程;(3)晚期反应:在细胞溶胶内黄质醛转变成ABA。（1）、早期反应阶段 在质体内MVA是合成五个碳原子PIP的前体。Rhomer等(1999)认为PIP生物合成是在叶绿体中以甲从赤醉糖磷酸(MEP)途径合成的:以丙酮酸及硫胺素焦磷酸(TPP)为前体,在3一磷酸甘油醛(GAP)参与下由5一磷酸脱氧木酮糖合成酶(DX)s催化形成5一磷酸脱氧木酮糖(DXP),进而在胞彗是磷酸(CTP)参与下形成PIP。也有报道指出PIP的生物合成分别也在细胞溶胶发生。同位素实验证实,甲瓦龙酸素(Mevniolni)阻碍MVA合成,但不影响类胡萝卜素合成。PIP

4、的生物合成可能与MVA途径无关。细胞溶质生成的PIP通过载体渗人到质体内。 GGPP由八氢番茄红素合酶(PSY)催化GGPP形成八氢番茄红素,这是一个限制步骤。随后八氢番茄红素脱氢酶(PDS)促进八氢番茄红素转变成胡萝卜素、番茄红素和日胡萝卜素。山于发育的玉米种子PDSmRNA表达的产物与内源ABA水平没有直接联系,番茄的PSY基因(PSY)I超表达不能引起ABA水平增加,推测类胡萝卜素的合成速率不会影响ABA的生物合成速率。日前,对DXS在调节类胡萝卜素生物合成的作用引人关注,令人惊讶的是,DXS的表达也影响着内源ABA水平(Est己vezetal,2001),说明ABA生物合成的早期阶段,

5、尤其是DXP的形成调节ABA生物合成。（2）、中期反应阶段 玉米突变体VP2、VP5、VP7、VP9的突变与玉米黄质形成相关。环氧玉米黄质环化酶(zEP)催化长米黄质环化形成环氧玉米黄质、进步形成全一反式一紫黄质,这两步反应是合成ABA的特殊步骤。拟南芥baal和烟草baZa突变体由于损害ZEP而阻碍ABA的生物合成。紫黄质及新黄质在9一顺环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)作川一l氧化裂解,在细胞溶胶形成黄质醛。已在植物中至少获拐了15种与ABA合成有关的突变体,其中大部分与玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9一环氧顺类胡萝!、素双力11氧酶(NCED)和醛氧化酶(AO)等以及相关辅因子突变有关。Z

6、EP、NCED和AO是生物合成的关键酶。其次,一些IPP合成有关的酶,某些异构酶和特定的辅因子如钥辅因子(MOCO)、铂辅因子硫酸化酶(MCSU)等以及细胞膜类固醇都调节ABA的合成。 ZEP是ABA生物合成中第一个从DNA及氨基酸序列水平上研究证实的酶。烟草中由ABA2基因编码ZEP,分子量72.5KD,是一个叶绿体输入蛋自,催化玉米黄质环氧化形成新黄质。ABA2蛋自首先催化长米黄质转化成环氧玉米黄质,进而在还原型铁硫蛋自作用下转化成新黄质,同时去环氧化酶作用新黄质逆转形成玉米黄质。已知玉米黄质、环氧玉米黄质、新黄质都与聚光复合体(LHC)耦连,因而认为玉米黄质转化成新黄质及逆过程(叶黄素循

7、环)可能保护LHC免遭光氧化。11前已经在胡椒、番茄、烟草中克隆到了同源玉米黄质环氧化酶cDNA,对ABA2基因编码的ABA2蛋白及其它同源基因产物的结构分析表明,ZEP有4个关键区:A、B、C、D区。涉及全一反式紫黄质转变成9一顺式或9一新黄质的酶仍有待提取。从番茄或马铃薯克隆的一个基因编码的蛋自具有催化全一反式一紫黄质到全一反式一新黄质的能力,用突变体分析证实在植物活体内该蛋自不具备上述功能(Hirsehberg,2001)。 在拟南芥、油菜、首倩、烟草等中发现形成种子至成熟过程的1/3和1/2处时间处,ABA的水平会显著增加,并在烟草中证实ABA2mRNA水平在这个阶段出现高峰,ABA2

8、基因表达调节着ABA合成及种子的发育。同样用转基因方法使ABA2基因超表达,能延长种子休眠;用反义RNA技术可打破休眠。种子胚中ABA2基因的表达、ZE水平限制ABA生物合成。在非光合组织如番茄根中,ABA水平的增加与特定的叶黄素减少成线性关系。所以ABA2编码的ZE及与黄质醛裂解有关的酶可能是调节ABA生物合成的关键酶。但这只是在非光合组织中实验的结果,在光合组织叶中,干旱条件下ABA2mRNA水平呈周期性变化,但不影响ABA的合成,ZEP可能不是ABA合成的关键酶。NCED(9一顺一环氧类胡萝卜素双加氧酶)在质体切割裂解9一顺新黄质和9一顺紫黄质形成黄质醛,是叶中ABA合成的关键调节酶,在

9、光照期结束时NCED表达最强。对比之下,ZEP表达在光照中期最大,说明影响ABA合成的每个基因存在不同的调节系统,导致不同的昼夜节律。在玉米胎生突变体VP14中发现VP14基因产物有裂解新黄质的作用,分析VP14基因序列,发现其与种细菌木质茋酶相似。已知木质茋酶可催化类胡萝卜素裂解(Koomneefctal,1998)。重组的VP14蛋自在氧气,亚铁离子,抗坏血酸及一定的去垢剂存在时,离体条件也可切割9一顺叶黄素,对玉米叶片的Northemblotting表明,萎蔫时VP14基因诱导与ABA的增加一致,因而推测VP14编码的蛋自可能催化9一顺新黄质及9一顺紫黄质的裂解反应。NCED在果实成熟、

10、萎蔫、缺水等过程或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。萎蔫过程中VP14的表达与ABA水平的升高成平行关系。NCED基因是一多毯因家族VP14、PaNCEDIPaNCEDZ都是9一顺环氧类胡萝卜素双氧酶家族中的成员(Chemysctal,2000)。从鳄梨中提取二种与NCED相关的cDNAs,玉米、大豆、拟南芥、番茄及鳄梨中NCED的氨基酸序列60%同源(Burbidgeetal,1999)。Luchis等(2000)从与就豆脱水反应有关的cDNA中分离得到了一个9一顺环氧类胡萝卜素双加氧酶的同源cDNA片段,其编码的蛋自(uvNCED)用GST融合显示其能催化9一顺环氧类胡萝卜素裂解。用

11、sGFP(合成的绿色荧光蛋自)融合试验发现vuNCED蛋白N一未端序列起到转运肽的作用,能将uvNCED转运至质体内。在鳄梨中分离得到了三个NCED同源cDNA,即PaNCEDI、PaNCEDZ和PNaCED3,发现NCED组织特异性表达,PaNCEDI和PaNCED3能催化9一顺式紫黄质和9一顺一新黄质转变为黄质醛,与果实成熟中ABA水平变化一致。PaNCEDI在叶中高度表达,脱水能诱导其表达。PaNCED3不能在叶片表达。玉米Vp14(ZmNCED1)也不能在日片表达,只在胚乳和根高度表达。在Pv14突变体胚乳的ABA水平低于野生型,但在正常(非胁迫)叶片中突变体和野生型的ABA含量却没有

12、差异。这些结果表明在正常(非胁迫)叶片是NCED基因而不是Vp14基因影响ABA生物合成。同样,拟南芥有9种NCED基因,各种基因表达有器官特异性。PaNCEDI及PaNCED3N一末端具有转运肤,类似于玉米、火豆中的NCED,能从细胞溶胶转运入质体起作用(ChemysnadZeevaart,2000)。目前的研究表明NCED是在细胞溶胶内合成后在转运肽引导下进入质体,再催化叶绿醇的氧化裂解的。NCED蛋白与玉米黄质环氧化酶相似,具有不同的功能关键区如N一末端转运肤区,可变区,催化反应的核心区等。保守区可能是底物与辅因子结合的区域。豆在干旱环境中编码ZEP的VuABAZ基因并不表达,但VuDC

13、EDI墓因却高度表达。在海棠根系中脂氧化酶(LOX)活性与ABA的积累一致,用LOX的专一抑制剂去甲愈创木酸(MDGA)抑制LOX活性,结果发现胁迫诱导的ABA被阻断(杨洪强等,2000)。NCEDDCED为LOX的同功酶或同类酶,同样裂解C40类胡萝卜素。（3）、晚期反应阶段由黄质醛生成ABA推测有三条途径:(l)通过醛氧化酶(AO)作用将ABA醛转变成ABA,在空气中很容易转化成ABA。(2)AO催化黄质醛氧化成黄质醛酸,然后在短链脱氢酶/还原酶(SDR, 由ABA2基因编码作用下转变为ABA。对拟南芥aba3突变体及大豆叶蛋自用丙酮稀释(l倍),其沉淀物中证实黄质醛被醛氧化酶氧化形成黄质

14、醛酸,黄质醛酸很容易在醛氧化酶作用下转变形成ABA。因而ABA醛可能是ABA生物合成的最直接前体。上述两条途径受植物体在不同的发育阶段或不同器官而变化调节。(3)当ABA醛转变成ABA的途径受到影响时,ABA醛先转变为ABA醇,ABA醇可在细胞色素P一450氧化酶作用下在氧的条件下氧化形成ABA。在离体条件下,植物体内ABA合成的最后阶段可能经黄质醛、黄质醛酸,1,4一反式ABA二醇等中间产物步骤。其中,4-OH氧化和l,2,一环氧异构化形成l一OH和2,一烯等过程还有待研究。番茄突变体fla和sit由于缺乏醛氧化酶不能将2H一ABA醛和2H一ABA醇转化成顺式一ABA。用柑橘外果皮无细胞系实

15、验证实紫黄质可裂解形成黄质醛,黄质醛在醇脱氢酶作用下形成不稳定的4一酮黄质酸,再转变成ABA醛、氧化形成ABA。, 一类胡萝卜素(胁迫及发育调控下在细胞溶胶内发生的反应)是ABA生物合成的两个直接前体物质。在植物体内黄质醛”黄质酸*4,一酮-黄质酸、ABA。4一酮一黄质酸具有与ABA许多相似的理化性质,胁迫诱导产生的4一酮一黄质酸在12环氧发生异构化成1一羟基。ABA缺乏突变体积累2一反一ABA。由2一顺一ABA醛,2一顺一ABA醇*2一顺一ABA(具生物活性),然而2一顺一ABA醛来白于2一反一ABA醇,由黄质醛转变为2一反一ABA醇的可能性小,只能是由2一顺一黄质醛*2一顺一ABA醛2一顺

16、一ABA醇*2一反一ABA,因而2一反一ABA醇可能是E,E-类胡萝卜素裂解或法呢基焦磷酸(FDP)代谢重新合成的。植物体存在法呢醇库用于类异戊二烯脂肪的生物合成。FDP经过氧化还原反应转变成E,Z一法呢基醇,去饱和作用生成2,4,6一脱氢一法呢基醇,通过环化、羚基化形成2一反一ABA醇。2一反一ABA醇葡糖基化,水解和异构化后产生2一顺-ABA醇,最后氧化成2一顺一ABA。S一ABA主要来自9,2一xanthhyll裂解;XAN代谢与ABA生物合成可能不属于同过程。ABA生物合成中间产物如ABA醇和4一酮一黄质酸等与体内一些物质化合后所形成的聚合物称为ABA加合物(daduct),有ABA酮

17、(如ABA醇毗喃葡萄糖普与多肤结合)和烯醇(如4一酮-黄质酸与多肤结合)两种类型,它们不是由ABA或ABA醛转变而来。胁迫下加合物释放ABA到质外体中参与生理调控。目前认为ABA加合物是ABA的前体,因为在洋葱中,从加合物中释放的甲基ABA(meABA)中标记的3H高度富集,而在游离的ABA中相对较少。但在番茄茎尖中,2H3一ABA醛并不进人加合物,带有新合成的ZH的ABA加合物可能是由于叶绿体中有高浓度的新合成的ABA交换进入加合体后形成的。ABA加合物的结构及其转变成ABA的途径还有待研究确证。高等植物存在的AO催化叫吲哚乙醛氧化形成叫吲哚乙酸,影响ABA生物合成的后面阶段反应。AO基因也

18、是一多基因家族。在番茄中证实,AO由两个15OKD的同源亚基组成,含有结合两个Fe一S的中心和一个辅助因子(MoCo)的位点,具有器官特异性。SDS免疫分析,大麦根部的AO由140KD和160KD亚基组成,叶和种子为160KD的单肤拟南芥AO至少有4个同源或异源二聚体,AOa(AAOl-AAo)l、AO比AAOI一AAO2)、AOY(AAO2一AAO2)和AO6(AAO3一AAO3),它们在不同的组织或器官分布,具有不同的底物要求,依赖于相关基因的表达。AO6在叶特异ABA合成中起作用。很多植物拟南芥、大麦、吞茄、烟草等证实存ABA合成的缺失突变体,如大麦narZa、拟南芥baa3、马铃薯dr

19、oopy、番茄na、烟草baal/kcrl等突变体。其中大部分是缺乏ABA醛氧化转变成ABA过程的酶系。AO有广泛的底物特异性,不仅可催化ABA一dl转化成ABA,而且能催化AIA一dl转化成AIA,催化黄质醛氧化形成黄质醛酸。已知AO、XDH、NR及亚硫酸氧化酶(50)都是依赖于钥辅因子酶,NR和50需辅助因子双氧中心,而AO和xDH则需一单氧钼及一个硫(此反应是在辅助因子硫酸化酶作用下完成的)。AO、xDH与NR的作用方式可能有所不同。AO和xDH的氨基酸序列高度同源,必须在MoCO硫酸化后才具有活性。Sagi等(1999)在番茄fla突变体的离体茎及野生型番茄提取物中,存在XDH和AO蛋

20、白,用NaZS硫酸化MoCO可以激活XDH朴1AO。从拟4Ij芥中分离鉴定出两个等位的突变体1055一1和1055一2(Xiongetal,2001)。遗传分析证实拟南芥1055基因是baa3的等位基因,编码钥辅因子硫酸化酶(MSCU)。MSCU与类Nisf蛋自相比,N末端高度相似,C末端高度同源。类Nisf蛋白在体外可催化半胧氨酸去硫化形成酪氨酸和硫醚。由于1505/baa与其它生物体的MSU具有高度的同源性,Nif有硫化作川必需的半胱氨酸和PLP结合模式,所以MSCU在辅助因子硫化作用中起着关键性作用。干旱、盐、ABA处理拟南芥突变体1055激活1055基因表达,ABA水平也同时上升。因此

21、,loss/ABA3可能是ABA合成、胁迫反应基因表达及胁迫毒害中关键性的调节因子,最近又分离获得了baal的等位基因1056,其调控渗透胁迫反应基因的表达,与玉米黄质的环氧化有关。用高渗培养法从拟南芥中分离得到两个突变体sre和asfi,其缺乏短链脱氢酶/还原酶,进而发现了4个新的ABAZ等位基因,它们的产物在NAD存在时催化新黄质转化成黄质醛,进一步证明了新黄质脱落醛ABA的转化途径。二、ABA受体的研究自20世纪70年代以来, 受体鉴定一直是ABA信号转导通路研究的重点和难点。有研究表明, ABA受体可能定位于质膜或其它亚细胞结构, 它能够识别并特异性结合ABA, 进而激活下游信号通路并

22、引发相应的生理反应(吴忠义等, 1998; Finkelstein et al., 2002)。自2006年FCA被报道为ABA受体以来(Razem et al.,2006), 相继报道了ABAR/CHLH、GCR2、GTG1/2和PYR/ PYL/RCAR是ABA的受体蛋白, 为植物中ABA信号转导通路的阐明奠定了重要基础(Shen etal., 2006; Liu et al., 2007a; Ma et al., 2009; Pandeyet al., 2009; Park et al., 2009)。本文将重点介绍各个受体(FCA除外)的研究情况。（1）ABAR/CHLHABAR/CH

23、LH是定位于植物细胞质体/叶绿体的镁离子螯合酶H亚基。它不但可催化细胞叶绿素的合成,而且在应激条件下能够参与质体/叶绿体与细胞核之间的信号反向传递(Walker and Willows, 1997; Mochizuki et al., 2001)。2002年, 张大鹏研究组首次从蚕豆(Vicia faba)叶片中分离纯化了(+)-ABA特异性结合蛋白, 暗示其具备ABA受体特征, 并将其命名为ABAR(Zhang et al., 2002)。随后, Shen等(2006)的研究表明, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)的同源蛋白ABAR/CHLH同样能与(+)-ABA特异性结合

24、, 且符合受体与配体结合的动力学特征; 同时, 根据相关转基因材料在种子萌发、幼苗生长和气孔运动等生理实验中的表型以及ABA信号应答基因表达, 推断ABAR/CHLH可作为受体蛋白正调控拟南芥ABA信号应答反应。但Mller和Hansson(2009)的研究显示,大麦(Hordeum vulgare)中的ABAR/CHLH同源蛋白XanF不能与(+)-ABA特异性结合, 其突变体也未表现出ABA信号应答相关表型, 故对ABAR/CHLH作为ABA受体蛋白提出了质疑。作为回应, 张大鹏研究组通过实验进一步证明了ABAR/CHLH蛋白的C-端是与(+)-ABA特异性结合的关键区, 并在ABA信号应

25、答过程中发挥着中心作用。同时, 依据单子叶植物大麦XanF和水稻(Oryza sativa)CHLH都能与(+)-ABA特异性结合并发挥生物学功能, 推测Mller和Hansson得出上述结果的原因可能是XanF基因功能冗余亦或是实验操作不当(Wu et al., 2009; Shang et al., 2010; 张大鹏, 2011)。另外, Shang等(2010)通过对ABAR/CHLH的深入研究, 发现作为跨质体/叶绿体被膜蛋白, 其C-端和N-端均暴露在细胞质中, 这为定位于质体/叶绿体被膜的ABAR/CHLH受体蛋白识别和传递ABA信号提供了重要线索。可是, Tsuzuki等(20

26、11)根据放射性ABA测定系统及相关突变体表型实验结果提出,ABAR/CHLH能够介导ABA信号调控的气孔运动, 但不是作为ABA受体, 并推测镁螯合酶可能以整体形式参与调控气孔的运动。因此, ABAR/CHLH是否作为受体蛋白参与ABA信号转导通路尚不能完全确定。我们仍然需要应用恰当的实验手段证实ABAR/CHLH是以受体蛋白形式识别和传递ABA信号, 还是以调节因子形式参与ABA信号应答。（2）GCR2Jeannette 等 (1999) 和 Pierce 等 (2002) 的研究表明 ,ABA信号的识别可能发生在细胞外,因而定位于细胞质膜的G蛋白耦联受体成为ABA受体的热门候选。马力耕研

27、究组应用生物信息学、遗传学和生物化学等手段证明, 具有G蛋白耦联受体特征的GCR2蛋白能与(+)-ABA特异性结合, 调控拟南芥ABA信号应答反应,并以GCR2蛋白为受体构建了ABA信号转导通路模型(Liu et al., 2007a)。正常条件下, GCR2蛋白的C-端与G蛋白的亚基(G protein subunit, GPA1)相互作用形成复合体,ABA与GCR2蛋白的特异性结合诱使G蛋白释放, G蛋白随后分离为G和G二聚体,并分别通过作用于其下游的效应因子调控ABA的信号应答反应(Liu et al., 2007a)。但是, GCR2蛋白行使ABA受体功能的报道很快就受到质疑。John

28、ston等(2007)借助硅模型和生物信息学分析指出, 拟南芥中的GC-R2既不是跨膜蛋白, 也不是G蛋白耦联受体, 它只是细菌羊毛硫氨酸合成酶的同源蛋白。虽然马力耕研究组针对该观点给予了回应, 并提出GCR2可能是一种新型的G蛋白耦联受体(Liu et al., 2007b), 但争论并未停止。Chen Jin-Gui研究组通过一系列实验证明,GCR2在拟南芥种子萌发及幼苗生长阶段不能参与调控ABA信号应答反应, 并推测该蛋白可能是真核生物LanC超级家族中的新成员(Gao et al., 2007; Chenand Ellis, 2008; Guo et al., 2008)。同时, Il

29、ling-worth等(2008)利用傅立叶变换算法解释了GCR2被误判为G蛋白耦联受体的可能原因。另外, Risk等(2009)同样证明了GCR2不能与ABA特异性结合, 尽管该实验中GCR2的分离纯化方式还需商榷。综上所述, GCR2能否作为受体蛋白参与ABA信号应答反应还有待进一步证实。（3）GTG1/2由G、G和G亚基组成的G蛋白协同G蛋白耦联受体及其下游效应因子在响应植物激素信号应答过程中发挥着重要作用(Assmann, 2004; Jones and Ass-mann, 2004)。2009年, Assmann研究组首次报道了2个具有G蛋白耦联受体特征的G蛋白, 并认为它们可能以G

30、蛋白或ABA受体形式行使ABA信号识别和转导功能(Pandey et al., 2009)。Pandey等(2009)首先通过生物信息学分析发现了2个与人类G蛋白耦联受体GPR89序列高度同源且具有9次跨膜结构、GTP结合域和退化的GTP酶激活蛋白结合域的GPCR型G蛋白, 分别命名为GTG1和GTG2。随后, 他们利用生物化学和遗传学等技术手段证实了GTG1/2具备G蛋白的所有基本特征, 并根据其能与(+)-ABA特异性结合以及相关突变体表型实验, 推断GTG1/2是2个定位于细胞质膜的ABA受体蛋白。在以GTG1/2为受体的ABA 信号转导通路模型中 , GPA1-GTP 通过抑制GTG1

31、/2蛋白酶活性促使GTG-GTP维持在较高水平,进而降低GTG-GDP与ABA的结合几率。相反, GTGs-GDP与ABA的结合可导致构型变化进而启动ABA信号应答, 但具体分子机制尚未阐明(Pandey et al.,2009)。除此之外, 与该受体相关的研究还存在多个问题需要解决。例如, 目前尚难以解释gtg1gtg2及gp-a1 突变植株在气孔实验中的表型 (Pandey et al.,2009); GTG1/2的人类同源蛋白GPR89实际上是高尔基体中调控离子平衡的阴离子通道(Maeda et al., 2008); 化学计量法检测发现只有1%的GTG1/2能与(+)-ABA结合等。G

32、TG1/2作为ABA受体蛋白同样受到了质疑。Pennisi(2009)认为该蛋白只是ABA信号转导通路中的调节因子之一, 或是受ABA调控的阴离子通道。另外, 关于GTG1/2与ABA的体外结合实验, Pan-dey等(2009)认为由于GTG1/2具有跨膜蛋白的性质,使得该蛋白质的纯化、溶解及复性过程等存在较大困难。尽管GTG1/2是否可作为ABA的受体尚未有定论,但对该蛋白的深入研究极大地促进了G蛋白信号转导通路与ABA信号应答的相互联系的研究。而且近年来与G蛋白相关的结构生物学研究可能会为阐明GTG1/2识别和传递ABA信号的分子机制奠定基础(Rasmussen et al., 2011

33、)。（4） PYR/PYL/RCAR上述几个ABA受体都受到了不同程度的质疑致使ABA受体的研究充满挑战性。2009年, Grill研究组以负调控ABA信号应答反应的蛋白磷酸酶ABI2为诱饵,应用酵母双杂交筛选法获得了一个START家族成员,命名为RCAR1(Ma et al., 2009)。有趣的是, Culter研究组同期报道了应用化学遗传学手段, 以人工合成的种子萌发抑制剂pyrabactin作为ABA信号应答选择性激动剂筛选到了ABA受体蛋白PYR1的工作(Park etal., 2009)。实际上, RCAR1与PYR1同属定位于细胞核和细胞质的START家族蛋白成员, 只是命名方式

34、不同。以此为基础, 这两个研究组继续通过一系列生物化学和遗传学手段证实了RCAR1和PYR1都能与ABA特异性结合, 进而与蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用, 导致其磷酸酶活性受到抑制而影响ABA信号应答反应。因此, Ma等(2009)和Park等(2009)推断RCAR1-ABI2蛋白复合物或PYR1可能作为受体蛋白参与ABA信号应答。随后, PYR/PYL/ RCAR被报道为ABA受体蛋白同样受到了广泛关注, 并最终得到了专家们的认可。Santiago等(2009b)以蛋白磷酸酶HAB1为诱饵筛选到相互作用的蛋白PYL5、PYL6和PYL8, 并重点阐明了PYL5作为受体蛋白介导ABA信号应答

35、的分子机制。Nishimura等(2010)以带YFP标签的蛋白磷酸酶ABI1为诱饵, 利用亲和纯化和质谱鉴定等方法鉴定到PYR/PYL/RCAR家族中的9个成员, 其中包括已被报道的ABA受体RCAR1和PYR1。更关键的是, 生物化学和结构生物学研究充分证实, PYR/PYL/RCAR是单独作为受体蛋白参与ABA信号识别的, 并生动展示了ABA、PYR/PYL/RCAR受体蛋白与蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用的分子机制, 这为阐明受体蛋白识别和传递ABA信号的过程提供了重要的理论依据(Melcher et al., 2009; Miyazono et al., 2009; Nishi-mur

36、a et al., 2009; Santiago et al., 2009a; Yin et al.,2009)。另外, 这一重要成果(PYR/PYL/RCAR受体蛋白的鉴定及结构解析)被评为2009年十大科学进展。PYR/PYL/RCAR家族共有14个成员, 其中13个成员(PYL13除外)的序列和结构具有高度保守性, 且都能与ABA相结合并抑制蛋白磷酸酶PP2Cs的活性,发挥ABA受体功能(Yuan et al., 2010)。针对各成员间响应ABA信号功能不明晰的现状, 颜宁研究组对已克隆的10个PYR/PYL/RCAR受体蛋白(PYL7、PYL11和PYL12除外)进行了系统生化分析,

37、 发现有部分受体蛋白无论ABA存在与否都能与蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用并抑制其活性(Hao et al., 2011)。随后, Hao等(2011)应用生物化学和结构生物学手段分析了受体蛋白PYL10不依赖ABA抑制蛋白磷酸酶PP2Cs的分子机制, 为深入探讨PYR/PYL/RCAR受体蛋白调控的ABA信号转导通路以及该家族受体蛋白的分类提供了结构和功能依据。总的来说, PYR/PYL/RCAR的筛选和鉴定无疑是ABA受体研究中的重大突破, 它合理地诠释了之前未能完全解释的实验现象。例如,(-)-ABA的生物学活性; ABA受体的功能冗余性; 蛋白磷酸酶突变体abi1和abi2对ABA的不敏

38、感现象(Hu-ang et al., 2007; Klingler et al., 2010)。这一重大突破有力地推动了植物ABA信号转导通路的阐明。三、 ABA信号转导通路模型的构建近年来, 随着遗传学、生物化学、细胞生物学和生物信息学等手段的广泛应用, 大量参与ABA信号转导功能的组分得到鉴定, 主要包括ABA受体蛋白、G蛋白、G蛋白耦联受体、蛋白磷酸酶、蛋白激酶、E3泛素连接酶、钙离子结合蛋白、RNA结合蛋白、磷酸、活性氧、MicroRNA以及各类转录因子(Finkelstein et al.,2002; Himmelbach et al., 2003; Xie et al., 2005

39、;Kuhn et al., 2008; Rushton et al., 2011)。这充分反映出植物中ABA信号转导通路的复杂性, 以及ABA信号调控在植物生长发育及响应外界应激过程中的重要性。因而, 植物中ABA信号转导通路的阐明对全面了解植物的生长和发育特性意义深远。（1） 以ABAR/CHLH为受体的ABA信号转导通路从受体蛋白的信号识别与传递到生物体呈现的生理生化应答反应,始终是信号转导研究需要阐明的中心问题。张大鹏研究组凭借对植物ABA信号转导通路多年来的研究积累, 以ABAR/CHLH为受体, 构建了从ABA信号原初识别及传递, 到植物体生理反应发生的ABA信号转导通路模型(Sha

40、ng et al., 2010)。该模型中, 结合ABA的ABAR/CHLH刺激转录因子WRKY-40从细胞核向细胞质转移, 并促进ABAR/CHLH与WRKY40两者间的相互作用, 进而阻遏WRKY40的表达, 导致WRKY40对ABA信号应答因子(如ABI5、ABI4、ABF4和MYB2)转录抑制的解除, 最终实现植物体的ABA信号应答反应(Shang et al., 2010; 张大鹏, 2011)。Shen等(2006)以拟南芥为材料进行生理实验时发现, ABAR/CHLH超表达植株在种子萌发、幼苗生长和气孔运动方面对ABA信号表现出高度敏感,而abar/chlh相关突变体以及RNAi

41、干扰植株的ABA信号应答反应正好相反, 符合ABAR/CHLH作为受体蛋白介导ABA信号应答的结论。另外, ABA负调控功能组分WRKY40的相关突变体也表现出对ABA高度敏感(Shang et al., 2010)。但是, Chen等(2010)的研究表明, wrky40突变体的ABA信号应答因子ABI5和DREB2A的转录水平以及生理表型均没有表现出ABA信号应答特征。目前, 已有证据表明转录因子ABI3、ABI4和ABI5可调控与种子发育相关蛋白(如SSP (seed storageprotein)和LEA (late embryogenesis abundant)基因的表达, 进而控制

42、种子的休眠或萌发(Holdsworth etal., 2008; Reeves et al., 2011)。在侧根发育过程中,转录因子ABI4通过抑制生长素输出载体PIN1的表达制约生长素的极性运输, 生长素水平的下降最终阻碍了侧根的 生长 发育(Shkolnik-Inbar and Bar-Zvi,2010)。最近, 张大鹏研究组发现了一个催化脂肪酸-氧化的3-酮脂酰辅酶A硫解酶KAT2, 该酶能够正向调控ABA信号的应答反应, 包括种子萌发、幼苗生长和气孔运动, 并推测其作用机理可能是调节植物细胞中活性氧的动态平衡。而且, 相关实验数据表明,KAT2作用于转录因子WRKY40的下游, 说明

43、其主要参与ABAR/CHLH介导的ABA信号转导通路(Jiang etal., 2011)。尽管如此, 以ABAR/CHLH为受体的ABA信号转导通路模型目前还不够成熟, 仍有许多问题亟待解决。例如, ABAR/CHLH受体蛋白如何识别并传递ABA信号; 转录因子WRKY40被转移和抑制的作用机制; ABAR/CHLH下游调节因子的筛选与鉴定(Sh-ang et al., 2010; 张大鹏, 2011)等。（2） 以PYR/PYL/RCAR为受体的ABA信号转导通路PYR/PYL/RCAR受体蛋白的鉴定是ABA受体研究的一个阶段性成果。通过对受体蛋白PYR/PYL/RCAR、蛋白磷酸酶PP2

44、Cs、蛋白磷酸激酶SnRK2s以及相关转录因子的系统和深入研究, 初步构建了以PYR/PYL/RCAR为受体的ABA信号转导通路模型(Fujii etal., 2009; Melcher et al., 2009; Miyazono et al.,2009; Nishimura et al., 2009; Park et al., 2009;Santiago et al., 2009a; Umezawa et al., 2009; Vladet al., 2009; Yin et al., 2009)。不存在ABA的条件下,以二聚体形式存在的PYR/PYL/RCAR受体蛋白不能与蛋白磷酸酶PP

45、2Cs相互作用, PP2Cs处于高活性状态并抑制其下游功能组分SnRK2s的活性, 植物体保持正常的生长趋势; 存在ABA的条件下, 细胞中的ABA与受体蛋白PYR/PYL/RCAR结合, 促使其构型发生变化, 形成能与PP2Cs相互作用的单体结构。结合了ABA的PYR/PYL/RCAR与PP2Cs相互作用能够完全掩盖PP2Cs的磷酸酶活性位点, 进而使SnRK2s的自我磷酸化与蛋白磷酸化活性得到释放。处于激活状态的SnRK2s一方面通过蛋白磷酸化作用激活下游转录因子ABA-responsive Element Binding Pro-teins/ABA-responsive Element

46、Binding Factors(AREBs/ABFs), 如AREB1/ABF2、AREB2/ABF4和ABF3, 正向调控ABA信号应答基因的表达(Fujita etal., 2009; Sirichandra et al., 2010; Yoshida et al.,2010); 另一方面直接作用于相关膜蛋白, 如阴离子通道Slow Anion Channel 1 (SLAC1)和钾离子通道Inward-rectifying Potassium ion Channel (KAT1)。SLAC1的激活促使胞内阴离子释放, 进而导致pH值升高和质膜去极化, 并随后激活外向钾离子通道。同时, 内

47、向钾离子通道KAT1经磷酸化作用受到抑制,协同促进胞内离子和水分的流失, 最终诱导气孔关闭(Geiger et al., 2009; Lee et al., 2009; Sato et al.,2009) 。此外 , SnRK2s 还可作用于定位于质膜的NADPH氧化酶AtrbohF, 催化胞外活性氧产生, 进而促使气孔关闭(Sirichandra et al., 2009)。活性氧水平的提高, 可反作用于PP2Cs, 进一步增强SnRK2s的酶活性, 形成正反馈循环模式。继阐明PYR/PYL/RCAR识别ABA信号并抑制PP2Cs酶活性的分子作用机理之后, 颜宁研究组根据SnRK2.6激酶域

48、的结构分析, 揭示了蛋白磷酸酶ABI1识别并抑制蛋白激酶SnRK2.6的分子机制, 这为理解ABA信号下游通路提供了重要线索(Xie et al.,2012)。与此同时, 徐华强研究组报道了ABA信号通路下游功能组分SnRK2s与PP2Cs的分子结构, 有效地解决了SnRK2s被抑制或激活的分子作用机理问题(Ng et al., 2011; Soon et al., 2012)。在未结合ABA的条件下, SnRK2s的活性环进入到PP2Cs的活性位点, 而PP2Cs保守的ABA识别位点色氨酸则插入到SnRK2s的催化裂缝区域, 激酶活性完全被抑制。巧合的是, 两者的结合方式与PYR/PYL/R

49、CAR和PP2-Cs之间的结合方式惊人的相似(Soon et al., 2012)。当SnRK2s的抑制被解除时, 激酶调节域中保守螺旋结构稳定的催化域促使其部分活性被释放, 导致活性环自我磷酸化并获得活性。当然, SnRK2s催化域的稳定性直接关系到其自我磷酸化的效率(Ng et al.,2011)。依据PYR/PYL/RCAR与PP2Cs的复合体结构,该研究成功地阐明了从受体蛋白PYR/PYL/RCAR到蛋白磷酸酶PP2Cs, 再到蛋白激酶SnRK2s的ABA信号核心通路分子机制, 这进一步验证了以PYR/PYL/RCAR为受体的ABA信号转导通路模型。四、 小结自19世纪60年代发现AB

50、A以来, 伴随其生理功能的不断揭示, ABA的生物合成、转运与降解、信号转导通路的阐明以及与其它激素之间的交叉对话等研究均取得了重要进展。其中, ABA受体的筛选与鉴定始终是ABA信号应答研究的关键问题。由于ABA受体功能冗余性以及突变体致死等因素, 正向遗传学的应用虽然在筛选ABA信号应答相关功能组分方面起了重要作用, 但对于ABA受体的鉴定却成效甚微。可喜的是, 研究人员利用生物化学手段在多种植物中发现了ABA结合蛋白的存在, 并成功分离了ABA潜在受体ABAR/CHLH。随后, 生物信息学的迅速发展促成了GCR2和GTG1/2的发现, 尽管两者作为ABA受体仍存在争议。直到最近, 蛋白质

51、相互作用组学和化学遗传学的广泛应用最终使得人们在ABA受体研究过程中取得了重大突破, 确定了第1个ABA受体家族, PYR/PYL/RCAR。ABA受体蛋白的明确又将成为ABA研究的新起点。5、 未来展望近几年 ABA 相关代谢研究已取得突破性进展，但仍有许多问题值得探讨。如高等植物中转录因子参与的合成代谢调控以及其中一些关键基因功能研究仍旧匮乏 ；信号转导中相关转录因子与下游基因的关系仍需确定 ；糖类、氨基酸及其他化合物调控ABA 信号稳定性方面的问题也亟待解决 ；植物ABA 响应除干旱和盐害之外的其他非生物胁迫的分子机制也有待完善。另外，更多转录因子的鉴定及功能研究也为揭示 ABA 在植物

52、生长发育及植物对环境胁迫的响应等方面中的作用提供助力，将这些理论应用于农业生产也是众多科研人员的夙愿根据目前已报道的ABA受体蛋白, 如何进一步鉴定有争议的蛋白？如何阐明分别以各个受体蛋白(包括PYR/PYL/RCAR家族中具有一定冗余性的13个受体蛋白)为中心的ABA信号转导通路, 以及各通路间的相互作用？仍是亟待解决的关键问题。生物学技术的迅猛发展为ABA信号转导通路的研究提供了重要保障。例如, 在以PYR/PYL/RCAR为受体的信号转导通路研究中, 结构生物学手段的应用为PYR/PYL/RCAR识别ABA信号, PP2Cs和SnRK2s被抑制或激活分子机制的阐明奠定了重要基础。总之,

53、关于ABA的研究虽已取得了阶段性成功, 但如何系统诠释其作用机制并联系实际应用始终是科研工作者的根本目标, ABA信号转导通路的阐明势必将为现代农业生产提供坚实的理论指导。六、参考文献1.Santiago J, Rodrigues A, Saez A, Rubio S, Antoni R,Dupeux F, Park SY, Marquez JA, Cutler SR, RodriguezPL (2009b). Modulation of drought resistance by theabscisic acid receptor PYL5 through inhibition of cla

54、de APP2Cs. Plant J 60, 575588.2. Sato A, Sato Y, Fukao Y, Fujiwara M, Umezawa T,Shinozaki K, Hibi T, Taniguchi M, Miyake H, Goto DB,Uozumi N (2009). Threonine at position 306 of the KAT1potassium channel is essential for channel activity and isa target site for ABA-activated SnRK2/OST1/SnRK2.6protei

55、n kinase. Biochem J 424, 439448.3.Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ,Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL,Liu R, Yu YT, Zhang DP (2010). The Mg-chelatase Hsubunit of Arabidopsis antagonizes a group of WRKYtranscription repressors to relieve ABA-responsive genesof inhibit

56、ion. Plant Cell 22, 19091935.4.Shen YY, Wang XF, Wu FQ, Du SY, Cao Z, Shang Y,Wang XL, Peng CC, Yu XC, Zhu SY, Fan RC, Xu YH,Zhang DP (2006). The Mg-chelatase H subunit is anabscisic acid receptor. Nature 443, 823826.5. Shkolnik-Inbar D, Bar-Zvi D (2010). ABI4 mediates abs-cisic acid and cytokinin i

57、nhibition of lateral root formationby reducing polar auxin transport in Arabidopsis. Plant Cell 22, 35603573.6. Sirichandra C, Davanture M, Turk BE, Zivy M, Valot B,Leung J, Merlot S (2010). The Arabidopsis ABA-acti-vated kinase OST1 phosphorylates the bZIP transcriptionfactor ABF3 and creates a 14-3-3 binding site involved inits turnover. PLoS One 5, e13935.Siri