第六章微生物

1、第六章 纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张稀释倒平板法首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.平板划线分离法分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）选择培养基分离法倾注平板法平板涂布分离法简单易行，但易造成机械损伤单细胞（单孢子）分离法要在显微镜下进行倾注平

2、板法比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.典型的生长曲线：课本153典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等 4 个时期延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内, 因代谢系统适应新环境的需要, 细胞数目没有增加的一段时期。该期的特点为: 生长速率常数为零; 细胞形态变大或增长, 许多杆菌可长成丝状细胞内的 RNA 尤其是 rRNA 含量增高, 原生质呈嗜碱性; 合成代谢十分活跃, 核糖体、酶类和 ATP 的合成加速, 易产生各种诱导酶; 对外界不良条件如 NaCl 溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。

3、影响延滞期长短的因素很多, 除菌种外, 主要有 3 种:1.接种龄 指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段时用来作种子的。这是指某一群体的生理年龄。实验证明, 如果以对数期接种龄的种子接种, 则子代培养物的延滞期就短; 反之, 如以延滞期或衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接种, 则延滞期居中。 2.接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来, 接种量大, 则延滞期 短, 反之则长因此, 在发酵工业上, 为缩短延滞期以缩短生产周期, 通常都采 用较大的接种量( 种子发酵培养基 = 110 , V/ V ) 。 3.培养基成分 接种到营养丰富

4、的天然培养基中的微生物, 要比接种到营养单调的 组合培养基中的延滞期短。所以, 一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量 接近, 且应适当丰富些。 出现延滞期的原因, 是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中, 一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶, 或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物, 就需要有一段用于适应的时间, 此即延滞期。 指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) , 指在生长曲线中, 紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。指数期的特点是: 生长速率常数R最大, 因而细胞每分裂一次所需的时间-代时，或原生质增加一倍所需的倍增

5、时间最短; 细胞进行平衡生长, 故菌体各部分的成分十分均匀; 酶系活跃, 代谢旺盛。影响指数期微生物代时长短的因素很多, 主要是:菌种: 不同 菌种其代时差别极大,营养成分: 同一种微生物, 在营养丰富的培养基上生长时, 其代时较短, 反之则长营养物浓度: 营养物的浓度既可影响微生物的生长速率, 又可影响它的生长总量，只有在营养物浓度很低( 0.1 2.0 mg/ mL) 时, 才会影响微生物的生长速率。随着营养物浓度的逐步提高( 2.0 8.0 mg/ mL ) , 生长速率不受影响, 而仅影响到最终的菌体产量。如进一步提高营养物浓度,则已不再影响生长速率和菌体产量了。凡处于较低浓度范围内可

6、影响生长速率和菌体产量的某营养物,就称 生 长 限 制 因 子培养温度: 温度对微生物的生长速率有明显的影响指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点, 故是用作代谢、生理等研究的良好材料, 是增殖噬菌体的最适宿主, 也是发酵工业中用作种子的最佳材料稳定期稳定期又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数 R 等于零, 即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等, 或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达到了最高点, 而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系,进入稳定期时, 细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; 芽孢杆菌一

7、般在这时开始形成芽孢; 有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体, 通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。所以, 次生代谢物又称稳定期产物。由此还可对生长期进行另一种分类, 即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成期。稳定期到来的原因是: 营养物尤其是生长限制因子的耗尽; 营养物的比例失调稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义, 例如, 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产来说, 稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定(bioassay) 来说, 稳定期是最佳测定时期; 此外,通过对

8、稳定期到来原因的研究, 还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建衰亡期( decline phase 或 death phase)在衰亡期中, 微生物的个体死亡速度超过新生速度, 整个群体呈现负生长状态。这时, 细胞形态发生多形化, 例如会发生膨大或不规则的退化形态; 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ; 有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物; 而在芽孢杆菌中, 往往在此期释放芽孢; 等等。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利, 从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢, 继而导致大量菌体死亡。恒浊与恒化培养的区别

9、装 置控制对象培养基培养基流速生长速率产 物应用范围恒浊器菌体密度无限制生不恒定最高速率大量菌体或与菌体相平生产为主( 内控制)长因子行的代谢产物恒化器培养基流速有限制生恒定低于最高速不同生长速率的菌体实验室为主( 外控制)长因子率厌氧菌因不能合成 SOD, 所以根本无法使 O2 歧化成 H2 O2 , 因此, 在有氧存在时, 细胞内形成的 O2 就 使 自 身 受 到 毒 害PH调节：过酸时: 加 NaOH、Na2 CO3 等碱液中和 “治标”过碱时: 加 H2 SO4 、HCl 等酸液中和 过酸时 加适当氮源: 加尿素、NaNO3 、NH4 OH 或蛋白质等 提高通气量“治本” 过碱时 加

10、适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等 降低通气量灭菌( sterilization)：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施, 称为灭菌, 灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation) 和溶菌( bacteriolysis) 两种, 前者指菌体虽死, 但形体尚存; 后者指菌体被杀死后, 其细胞因发生自溶、裂解等而消失的现象消毒：是采用较温和的理化因素, 仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施1. 干热灭菌法(dry heat sterilization)把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘

11、箱内, 在 150170下维持 1 2 h 后, 可达到彻底灭菌的目的。干热可使细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥, 并可使各种细胞成分发生氧化变质。灼烧是一种最彻底的干热灭菌法, 可是因其破坏力很强, 故应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。2. 湿热灭菌法(moist heat sterilization)湿热灭菌法是指用 100以上的加压蒸气进行灭菌。在同样温度和相同作用时间下, 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效, 原因是湿热蒸气不但透射力强, 而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键, 从而加速这一重要生命大分子物质的变性。在湿热温度下, 多数细菌和真菌

12、的营养细胞在 60左右处理 5 10 min 后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些, 要在 80下才被杀死, 细菌的芽孢最耐热, 一般要在120下处理 15 min 才被杀死。巴氏消毒法: 因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒, 故名。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌 , 又不影响其原有风味。巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法, 处理温度变化很大, 一般在 6085处理 30 min 至 15 s。具体方法可分两类: 第一类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在 63下维持 30 min 即可;

13、 第二 类是较现代的高温瞬时法, 用此法作牛奶消毒时只要在 72下保持 15 s。煮沸消毒法: 采用在 100下煮沸数分钟的方法, 一般用于饮用水的消毒。3.间歇灭菌法: 又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是: 将待灭菌的培养基放在 80 100下蒸煮 1560 min , 以杀灭其中所有的微生物营养体, 然后放至室温或 37下保温过夜, 诱使其中残存的芽孢发芽, 第二天再以同法蒸煮和保温过夜, 如此连续重复 3 天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的良好效果。4常规加压蒸气灭菌法: 一般称作“高压蒸气灭菌法”, 但因其压力范围甚低， 故改用“加压”两字更合适。这

14、是一种利用高温进行湿热灭菌的方法, 优点是操作简便、效果可靠, 故被广泛使用。其原理是: 将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅内, 盖上锅盖, 并打开排气阀, 通过加热煮沸, 让蒸气驱尽锅内原有的空气, 然后关闭锅盖上的阀门, 再继续加热, 使锅内蒸气压逐渐上升, 随之温度也相应上升至 100以上。为达到良好的灭菌效果, 一般温度应达到 121, 时间维持 1520 min。有时为防止培养基内葡萄糖等成分的破坏, 也可采用在较低温度下维持 35 min 的方法。加压蒸气灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材或物料的灭菌热死时间, 指在某一温度下,

15、杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。热死温度, 又称热死点, 指在一定时间内, 杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度影响加压蒸气灭菌效果的因素1. 灭菌物体含菌量2. 灭菌锅内空气排除程度3. 灭菌对象的 pH4. 灭菌对象的体积5. 加热与散热速度灭菌锅空气没有排尽有啥影响：因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。 抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物, 它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物( 包括病原菌, 病毒, 癌细胞等) 的生命活动, 因而可用作优良的化学治疗剂

16、。第七章什么叫杂交育种及其理论基础与区别诱变育种的整个过程诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群, 在促进其突变率显著提高的基础上, 采用简便、快速和高效的筛选方法, 从中挑选出少数符合目的的突变株, 以供科学实验或生产实践使用。 表型( phenotype ) 指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和, 是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。所以, 它与遗传型不同, 是一种现实性。饰变(modification) 指外表的修饰性改变, 即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样

17、变化; 性状变化的幅度小; 因其遗传物质未变, 故饰变是不遗传的。模式生物特性：物种与代谢类型的多样性; 个体的体制极其简单; 营养体一般都是单倍体; 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖; 繁殖速度快; 易于积累不同的中间代谢物或终产物; 菌落形态的可见性与多样性; 环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性; 易于形成营养缺陷型突变株; 各种微生物一般都有其相应的病毒; 以及存在多种处于进化过程中、富有特色的原始有性生殖方式等质粒：凡游离于原核生物核基因组以外, 具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子, 即cccDNA与筛选营养缺陷型突变株有关的3 类培养基:基本培养

18、基: 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基, 称基本培养基。完全培养基: 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基, 称完全培养基。补充培养基 : 凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基, 称补充培养基。与营养缺陷型突变有关的3 类遗传型个体:野生型 : 指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。营养缺陷型: 野生型菌株经诱变剂处理后, 由于发生了丧失某酶合成能力的突变, 因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长, 这类突变菌株称为营养缺陷型突变株, 简称营养缺陷型。原养型: 一般指营养缺陷型突变株经回复突

19、变或重组后产生的菌株, 其营养要求在表型上与野生型相同,夹层培养法: 先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基, 待凝, 添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基, 其上再浇一薄层不含菌的基本培养基, 遂成“ 三明治”状。经培养后, 对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后, 再向皿内倒上一薄层第四层培养基完全培养基。再经培养后, 全长出形态较小的新菌落,它们多数都是营养缺陷型突变株。若用含特定生长因子的基本培养基作第四层, 就可直接分离到相应的营养缺陷型突变株。限量补充培养法: 把诱变处理后的细胞接种在含有微量蛋白胨的基本培养基平板上, 野生型细胞就迅速长成较大的菌落, 而营养缺陷型则因营

20、养受限制生长缓慢, 只形成微小菌落。若想获得某一特定营养缺陷型突变株, 只要在基本培养基上加入微量的相应物质就即可。逐个检出法: 把经诱变剂处理后的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上, 待长成单个菌落后, 用接种针或灭菌牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上, 使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后, 如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落, 而在基本培养基的相应位置上却不长, 说明此乃营养缺陷型。影印平板法: 将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上,经培养后, 使其长出许多菌落。然后用影印接种工具, 把平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后, 比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落, 而在后一平板上的相应部位却呈空白, 说明这就是一个营养缺陷型突变株。基因重组：两个独立基因组内的遗传基因, 通过一定的途径转移到一起, 形成新的稳定基因组的过程。