T-SPOT-TB说明书翻译

1、T-SPOT.TB用于结核感染的诊断8孔反应板条规格（TB.300）说 明 书用于体外诊断T-SPOT.TB 88孔反应板规格（TB.300）内容目录 页码预期用途 3前言 3原理 3局限性 4安全警告及防范 4原料 5储藏条件 5稳定性 5仪器和配套试剂 5试剂准备 6步骤 6样本采集和准备 6细胞的洗涤和记数 7板条组装和孵育 7斑点记数 8质量控制 9结果解释和判断标准 9性能指标 10参考文献 10术语和标识 11预期用途T-SPOT.TB是一种体外诊断试剂，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的ELISP

2、OT检测方法。酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学新技术前言结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4（Cluster of Differentiation 4）和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数1,2。从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（Bacillus Calmette - Guerin）（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。两个单独

3、的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得ELISPOT检测更加的灵敏超过传统的ELISA实验5。T-SPOT.TB被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞3、4、6-9。T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群10、11，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况。原理外周血单个核细胞（PBMCs）外周血单核细胞(Per

4、ipheral Blood Mononuclear Cells)从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。每个样本需要4个检测孔（图1）：1、 空白对照为了判断非特异细胞的活化反应2、 结核特异抗原A，Panel A(ESAT-6)3、 结核特异抗原B，Panel B(CFP 10)4、 植物血凝素PHA对照，用于判断PBMC活性植物血凝素(Phytohaemagg

5、lutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。通过洗涤去除任何未标记的抗体。可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个分泌细胞因子的

6、T细胞，记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。局限性l 仅用于体外诊断l 仅供专业人员使用l 未开瓶试剂盒保存在2-8环境下。在试剂盒标签上的有效期内使用l 开瓶的试剂保存在2-8环境下。开瓶有效期8周，但不能超过试剂盒的有效期l 不同试剂盒批号的试剂不能混用l 使用前仔细阅读说明书l 注意无菌操作避免试剂，检测孔，细胞悬液和细胞培养液的污染l 不同的分离和洗涤技术、培养时间和/或温度将会影响实际的操作结果，应当避免l 血液样本从采集到检测不超过8小时l 室温保存和运输血液样本（18-25），不能冷冻或冷藏l T-SPOT.TB结果需结合临床和其它检测进行判断l 阴性结果不能排除暴

7、露或感染结核杆菌的可能性l ESAT-6和CFP 10抗原在卡介苗（BCG）和大多数环境分枝杆菌中都缺失，除了M.kansasii，M. szulgai ，M. marinum，和M. gordonae安全警告和预防当操作人源性样本时应当注意，所有血液样本都有潜在的传染性。处理血液样本和试验组分时，它们的使用，储存和处理应当与当地的国家生物安全指导指南或规章相一致。在使用化学试剂时应当注意所有的化学试剂都有潜在的危害原材料T-SPOT.TB 8：1、 微孔培养板板1块：96孔，由128孔的板条组成，包被有小鼠抗人的干扰素单抗（INF-）2、 抗原A 2瓶（0.8ml每瓶）：含有ESAT-6抗原

8、，牛血清白蛋白和抑菌剂3、 抗原B 2瓶（0.8ml每瓶）：含有CFP 10抗原，牛血清白蛋白和抑菌剂4、 PHA对照2瓶（0.8ml每瓶）：含有植物血凝素PHA，用于细胞活性的监控，牛血清白蛋白和抑菌剂5、 200倍浓缩的标记抗体1瓶（50l）：含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人-干扰素单抗6、 显色底物溶液1瓶（25ml）：含BCIP对甲苯胺蓝/NBTplus7、 CD光盘1张：含使用说明书，技术手册，MSDS文件，操作指南和报告软件储存试剂盒所有组分2-8储存底物显色溶液避光保存稳定性在推荐的条件下储存，试剂盒各组分在试剂盒标签上的有效期之内保持稳定实验仪器和试剂盒未包含的配套试剂1、 8孔

9、反应板条架2、 II级生物安全柜3、 采血管，例如BD的CPT管或肝素抗凝管4、 Ficoll淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque Solution),淋巴细胞分离液或PBMC分离液5、 水平离心机（温控（18-25），离心力不低于1800g）6、 PBMCs记数设备和试剂：使用台盼蓝肉眼机理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一

10、。显微镜手工记数或自动血细胞记数仪记数7、 37(1),5% CO2培养箱（保持湿润）8、 自动微孔洗板机或手工洗板设备9、 移液器及消毒的加样枪头10、 PBS缓冲液：例如GIBCOTM 1x D-PBS PBS(Phosphate buffer saline)（Invitrogen; catalogue number 14040-091）11、 蒸馏水或去离子水12、 ELISPOT读板仪或显微镜，放大镜13、 无血清培养基例如GIBCO AIM-VTM (Invitrogen; catalogue number 31035-025)：强烈推荐用于细胞孵育阶段。RPMI 1640 (Inv

11、itrogen; catalogue number 21875-034)仅用于样本最初的处理，培养液使用完毕后丢弃，推荐培养液分装使用。细胞培养液使用前预温至37试剂准备1、 微孔培养板。取出够数的8孔反应板条恢复至室温待用，其余板条与干燥剂一起放回铝箔袋中。2、 取出结核特异抗原ESAT-6（抗原A）待用3、 取出结核特异抗原CFP 10（抗原B）待用4、 取出植物血凝素对照待用5、 准备1:200稀释的标记抗体工作液，计算足够用的浓缩标记抗体工作液在使用之前配制6、 取出底物显色溶液恢复至室温待用步骤该试验的完成依赖良好的实验室习惯和严格按照使用说明书进行操作。Oxford Immunte

12、c公司已经准备了一系列的技术指导文件关于样本的采集和准备，培养液的选择与斑点记数方法。同样有用的的关键点和注意点在操作指南和技术手册中，所有这些技术文件可以电话联系+44 (0) 1235 442780或从下载得到。样本的采集和准备使用者应当先确认PBMCs采集的步骤，选择适当的培养液在实验的第一次孵育阶段维持细胞活性。具有代表性的，免疫力正常的患者，根据以下标准从静脉血样本中获得足够数量的PBMCs由于实验：l 成年人或10岁以上儿童：8ml或两管4ml静脉血l 2-9岁儿童：4ml静脉血l 2岁以下儿童：2ml静脉血血样本必须室温保存和当天检测细胞培养液使用前需预温至37步骤注意点1.依照

13、说明书的要求采集全血样本。室温保存（18-25），不能冷冻或冷藏1.血样本可用不同的采血管采集。在我们的实验室，已经成功的使用了BD的CPT管，肝素锂抗凝管。不推荐EDTA乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）抗凝管2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分离PBMCs。对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTMPlus按照操作说明分离PBMCs2.8ml CPT管分离条件：1600g，28分钟；4ml CPT管分离条件：1800g,30分钟，均为室温条件（18-25）。其它方法采集血样的，用RPMI 1640培养液等体积混匀。

14、按体积比2-3：1小心的加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，室温（18-25），1000g，离心22分钟。3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml尖底离心管中。加入细胞培养液至10ml。3.本步骤可以选择不同的细胞培养液洗涤。培养液AIM-V和RPMI 1640均被推荐使用。4.600g离心7分钟。弃去上清液用1ml培养液重悬沉淀。4.要求见第3点5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。5.要求见第3点6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。6.本步骤选择培养液重悬沉淀并孵育过夜，强烈推荐培养液AIM-V细胞记数和稀释T-SPOT.TB实验要求每个检测孔含有25万个细胞。

15、每个样本检测需要4个孔。每个检测孔都必须加入足够的细胞。错误的做法会导致结果的不正确。步骤注意点1.活细胞记数1.可采用不同的方法，包括台盼蓝染色手工记数或使用合适的设备自动记数。2.对于采用记数板手工记数，取10l细胞终溶液加到40l 0.4%(w/v)台盼蓝染液中混匀。调整记数板至合适的位置记数栅格里细胞数。其它类型的记数板或自动细胞记数仪，依照厂家说明书操作。2.注意确保细胞终溶液在稀释记数前被充分的混匀。细胞沉淀在离心管底部会导致记数结果与实际细胞数量发生偏差。3.计算细胞终溶液的浓度。3.确保正确计算细胞浓度，过多或过少都会导致结果的不准确。4.配制每100l含有25万个细胞的标准溶

16、液500l。 4.稀释前确保细胞悬液充分混允。培养板组装和孵育T-SPOT.TB实验要求每个样本4个检测孔。每个测试样本都设立空白对照和判断细胞活性的植物血凝素对照。推荐按以下方式排列：步骤注意点1.从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板架内恢复至室温。1.只取出够用的培养板条，其余的放回储存。培养板条嵌入空的培养板内盖上垫板和盖子。架子，垫板和盖子可以保留重复使用。2.每个样本需要用到4个检测孔：（1）加入50l细胞培养液至每个空白对照孔内。（2）加入50l抗原A溶液至每个必要的检测孔内；（3）加入50l抗原B溶液至每个必要的检测孔内。（4）加入50l植物血凝素溶液至每个细胞功能控制孔内。2.不

17、允许移液管枪头触碰反应孔底部的膜。枪头造成的压痕会导致孔内出现假象斑点。轻叩培养板使得试剂覆盖反应孔底部或许是必要的。避免过度用力导致反应孔间出现交叉污染。3.每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入100l细胞终溶液（含有25万个活细胞）3.每吸取100l细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔出现交叉污染。4.在37，保持湿润的含有5%CO2的培养箱中孵育16-20小时。4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。不要把培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。斑点形成与记数在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不

18、要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹痕会导致斑点假象，影响斑点记数。步骤注意点1从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。1此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。2每个反应孔加入200l PBS缓冲液3弃去PBS缓冲液。用新鲜的PBS缓冲液重复洗涤至少3遍3最后一遍洗涤结束后，弃去PBS缓冲液并在下一步骤前在吸水纸上拍干反应孔。4用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。4不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，这会导致高的本底结果。确保标记抗体工作液有少量剩余（考虑到耗损）。因而，对于8孔板条（每孔需要50l），配制500l标记抗体工作液，取2

19、.5l的浓缩标记抗体试剂加497.5l的PBS缓冲液5每个反应孔加入50l标记抗体工作液，2-8孵育1小时5不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正确。6弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤。每个反应孔加入200l PBS缓冲液弃去PBS缓冲液。用新鲜的PBS缓冲液重复洗涤至少3遍7.每个反应孔加入50l底物显色溶液室温孵育7分钟。8.用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应。9.在通风处或37温箱干燥培养板9.斑点会因为干燥而变的清晰。可以37温箱干燥4小时或室温过夜。10.记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。根据结果解释和判断标准（见下页）确定患者样本对结核抗原为“有反应性”或“无反应

20、性”。10.可以采用以下方法记数斑点数量，包括肉眼放大镜记数，合适的显微镜记数，专门的ELISPOT读板仪记数。质量控制通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而植物血凝素PHA对照孔斑点数超过20个。空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。此类样本的结果难以判断查阅T-SPOT.TB技术手册分析原因（下栽）。重新复查是必要的。具有代表性的，细胞活性植物血凝素对照孔斑点数应当超过20个或遍布整个反应孔（斑点数量太多）。极少数人群的T细胞对PHA无反应。当PHA对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”，除非抗原A或抗原B孔根据结果解释和判断标准（见下页）确定为“有反应性

21、”，此检测结果有效。基于生物学和反应体系的原因，当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行复查。虽然在卡介苗和大部分环境分枝杆菌中都缺失ESAT-6和CFP 10抗原，当感染M.kansasii, M.szulgai, M.marinum or M.gordonae时，T-SPOT.TB检测有可能出现“有反应性”结果。当怀疑上述细菌感染时有必要进行鉴别诊断。结果解释和判断标准在应用以下标准前请翻阅质量控制章节如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反应性”，参

22、照以下标准：空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）6空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）2（空白对照孔斑点数）检测结果为“无反应性”如果上述标准不符合且PHA对照孔正常时当PHA对照孔结果为“不确定”且抗原A和抗原B孔结果都为“无反应性”时，该实验结果被认为是“并不确定”应当复查。“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞性能指标特异性 分析评估93例志愿者样本，通过病史和个人信息认为来自于结核感染低风险地区。T-SPOT.TB的特异性为100%（9

23、5%可信限95.8%-100%）灵敏度 分析评估87例经培养证实的结核感染者样本，包括免疫力受抑制人群样本，T-SPOT.TB的灵敏度为98.8%（86/87）（95%可信限90.8%-99.9%）重复性 用批内差作为一个替代指标，对同一样本进行分析检测。来自140位志愿者的145例样本进行重复实验（抗原A和抗原B各做两次）142/145（97.9%）临床符合，2例样本结果在临界值上，只有1例重复实验结果不一致。重复精度 用批间差指标替代，分析评估在2块不同的培养板上进行。全部208例志愿者样本进行重复实验（抗原A和抗原B各做两遍，每块培养板上各做1遍）206/208（99%）临床符合率参考文献1. Janeway and Travers (1996) Immunobiology 2nd Ed.2. Staines et al (1999) In