6分子生物学研究法下-基因功能研究技术

1、1基因功能研究技术基因功能研究技术2分子生物学研究方法下分子生物学研究方法下基因功能研究技术361 基因表达研究技术基因表达研究技术基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术serial analysis of gene expression，SAGE是一种以测序为基础定量分析是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。型细胞或组织的基因表达信息。61 .1 基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术4原理：根据理论上任何长度超过原理：根据理论上任何长度超过910(49=262144)个碱基的核苷酸片

2、段可代表一种转录产物的特异序个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列转录本，因此，选择特定的限制性内切酶分列转录本，因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性离转录产物中这些代表基因特异性910个碱基的个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。应编码基因的表达频率。5SAGE程序程序:分离提取分离提取mRNA逆转录合成逆转录合成cDNA4bp碱基的锚定酶碱基的锚定酶AE以与生物素相连的寡聚以与生物素相连的寡聚

3、dT为引物为引物分离与抗生物素及微磁球分离与抗生物素及微磁球相连的相连的3 端端cDNA提取总提取总RNA63 端端cDNA分两份分两份分别与连接子分别与连接子1和连接子和连接子2连接连接标签酶标签酶TE切割切割DNA聚合酶聚合酶(Klenow)补平补平含有含有914个碱基的标签个碱基的标签标签标签1标签标签27标签标签1标签标签2连接酶连接连接酶连接双标签双标签(ditag)根据连接子根据连接子1和和2的序列的序列设计引物进行设计引物进行PCR扩增扩增电泳回收目的条带电泳回收目的条带锚定酶锚定酶AE切掉接头切掉接头串联入载体进行表串联入载体进行表达频率的分析达频率的分析89612 RNA选择

4、性剪切选择性剪切lRNARNA选择性剪接是指用不同的剪切方式选选择性剪接是指用不同的剪切方式选择不同的剪切位点组合从一个择不同的剪切位点组合从一个mRNAmRNA前体产前体产生不同的生不同的mRNAmRNA剪接异构体的过程。选择剪接剪接异构体的过程。选择剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。表达多样性的重要表现形式。10类型类型平衡剪切平衡剪切5选择性剪切选择性剪切3 选择性剪切选择性剪切相互排斥剪切相互排斥剪切外显子遗漏外显子遗漏5ss3ss5ss5ss5ss5ss3ss3ss3ss3ss5ss3ss11检检测测方方法法RT

5、-PCRcDNA以两端特异序列设计引物以两端特异序列设计引物观察观察PCR产物大小是否存在差异产物大小是否存在差异存在差异存在差异有选择性剪切有选择性剪切提取不同组织的总提取不同组织的总RNA分离分离mRNAPCR不存在差异不存在差异无选择性剪切无选择性剪切12613 原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术in situ hybridization，ISH是是用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。酸进行定位和相对定量研究

6、的一种手段。分分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。原位杂交和染色体原位杂交两大类。13 FISH的是用的标记单链核酸为探针，按照碱基互的是用的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原那么，与待检材料中未知的单链核酸进行补的原那么，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。而将特定的基因在染色体上定位。荧光原位杂交技术荧光原位杂交技

7、术 FISHfluorescence in situ hybridization14 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点等特点 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 15荧光原位杂交显示的着丝粒卫星荧光原

8、位杂交显示的着丝粒卫星DNA 荧光原位杂交显示的端粒荧光原位杂交显示的端粒 荧光素标记探针荧光素标记探针DNA染色体染色体DNA检测荧光素来确定与探针检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的序列杂交的互补序列在互补序列在染色体或染色体或DNA上的位置上的位置166.1.4 定点突变技术定点突变技术定点突变定点突变sitedirected mutagenesis是重组是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个些氨基酸残疾对蛋白质的结构、催研究某个些氨基酸残疾对蛋

9、白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。的酶切位点等。17体外定点突变的具体方法有三种：体外定点突变的具体方法有三种：1 1寡聚核苷酸介导的定点突变；寡聚核苷酸介导的定点突变；2 2双引物法定点突变重叠延伸技双引物法定点突变重叠延伸技术；术；3 3大引物诱变法。大引物诱变法。以上三种方法虽不同，但原理都一致。以上三种方法虽不同，但原理都一致。181、寡聚核苷酸介导的、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术突变技术序列的环状序列的环状DNA人工合成一段

10、引物人工合成一段引物变性变性模板模板定点突变定点突变细菌转化细菌转化延伸诱变寡核苷酸引物延伸诱变寡核苷酸引物DNA聚合酶聚合酶筛选引入突变的环状筛选引入突变的环状DNA192、重叠延伸技术、重叠延伸技术正向正向诱变诱变引物引物FM反向反向引物引物R2正向正向引物引物F2反向反向诱变诱变引物引物RM序列序列DNA模板模板在重叠区发生退火在重叠区发生退火PCR3使用引物使用引物F2和和R2扩增扩增PCR4全长突变全长突变DNA片段片段形成全长双链突变形成全长双链突变DNA反向互补反向互补产物产物产物产物21PCR203、大引物诱变法、大引物诱变法PCR1产物产物正向诱变正向诱变引物引物M反向引物反

11、向引物R1双链大引物双链大引物退火和野生型基因复性退火和野生型基因复性PCR2正向引物正向引物F2退火温度退火温度PCR2PCR1序列序列DNA模板模板全长突变全长突变DNA片段片段211 1易错易错PCRPCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选变，制造突变酶库以便筛选易错易错PCRPCR在采用在采用TaqTaq酶进行酶进行PCRPCR扩增目的基扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子浓度，改变浓度，改变dNTPdNTP的浓度等，改变的浓度等，

12、改变TaqTaq酶的突酶的突变频率变频率非定点突变非定点突变222 2DNADNA改组技术为代表的有性进化改组技术为代表的有性进化 DNA DNA改组又称为有性改组又称为有性PCRPCR，基本操作过程是从，基本操作过程是从正突变基因库中分离出来的正突变基因库中分离出来的DNADNA片段用酶随机切片段用酶随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCRPCR循循环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行扩环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段重组。的片段重组。 该策略将

13、亲本基因群中的优势突变尽可能组该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能组合在一起，最终酶分子某一性质进一步进化。合在一起，最终酶分子某一性质进一步进化。23单一基因DNA随机突变库正突变表型负突变表型易错PCR随机片段化随机片段库重聚PCR突变和重组基因随机重组库检测正突变重组子检测负突变重组子24622 基因敲除技术基因敲除技术概念：概念： 基因敲除技术基因敲除技术gene knockout)又称基因又称基因打靶打靶gene targeting。这种技术是通过基。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构但功能未知的基因因工程的方法将一个结构但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代又称去除，

14、或用其他序列相近的基因取代又称基因敲入，然后从整体观察实验动物，从基因敲入，然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。为基因敲除技术。25基因打靶的必备条件基因打靶的必备条件 打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体常用的

15、是胚胎干细是能接受外源基因的受体常用的是胚胎干细胞胞26打靶载体打靶载体targeting vectortargeting vector 通常，我们将外源基因通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导片段通过相应载体导入入ES细胞中。一个好的载体应具备以下特点：细胞中。一个好的载体应具备以下特点： 能在宿主细胞中稳定存在；能在宿主细胞中稳定存在； 具有一个以上的遗传标志，具有一个以上的遗传标志，27LoxP recombination sites: 942; 12211254Human U6 promoter ( PU6): 52308Chloramphenicol (Cmr ) open

16、reading frame : 1192533SacB negative selection marker: 12633173Ampicillinresistance gene:start codon: 33093311; stop codon: 41674169-pUC origin of replication: 43174960T7 RNA polymerase promoter: 50715089 28胚胎干细胞胚胎干细胞embryonic stem cell，ES ESES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES ES 细胞的特点：能在体外培养，并保留

17、发育的全细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。能性。 因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚胎移植入母鼠子宫内，使胎移植入母鼠子宫内，使ESES细胞有机会发育成细胞有机会发育成小鼠或某种组织小鼠或某种组织。29 一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一条染色体上的等位基因不再发生置换，因此，经同源条染色体上的等位基因不再发生

18、置换，因此，经同源重组后只能得到嵌合体小鼠重组后只能得到嵌合体小鼠chimeric mouse。 然后经过杂交育种，按孟德尔遗传规律，其后代中有然后经过杂交育种，按孟德尔遗传规律，其后代中有四分之一的几率为纯和子，这样经过将嵌合体小鼠和四分之一的几率为纯和子，这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，即基因即基因 敲除小鼠。敲除小鼠。 30基因敲除技术基因敲除技术完全基因敲除完全基因敲除条件型基因敲除条件型基因敲除1 1、完全基因敲除、完全基因敲除完全基因敲除是指完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞通过同源重组法

19、完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。或者动物个体中的靶基因活性。31基本原理基本原理:构建与靶基因同源构建与靶基因同源 (1015kb)的载体的载体外显子插有新霉素外显子插有新霉素抗性基因抗性基因 neor作为正选择的标志作为正选择的标志疱疹病毒胸苷激疱疹病毒胸苷激酶酶(HSV-tk)基因基因作为负选择作为负选择体外培养体外培养新霉素新霉素(G418)和致死核苷类似物和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选作双重筛选将重组体导入将重组体导入ES细胞细胞存活的存活的ES细胞细胞32方法方法表型分析表型分析构建载体构建载体同源重组同源重组筛选筛选X被敲除的被敲除的ES细胞细胞显微注射显微注射回交

20、得到回交得到X被敲除的动物被敲除的动物332、条件型基因敲除、条件型基因敲除 条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。 常用的条件型基因敲除有：常用的条件型基因敲除有：噬菌体的噬菌体的Cre/Loxp系统、系统、Gin/Gix系统系统酵母细胞的酵母细胞的FLP/FRT系统、系统、R/RS系统系统34构建打靶载体构建打靶载体同源重组同源重组筛选中靶筛选中靶ES显微注射显微注射杂交删除杂交删除neor基因基因特定阶段诱导特定阶段诱导Cre酶酶切除目的片段切除目的片段动物观察分析动物观

21、察分析Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序：重组系统进行条件性基因剔除的程序：体外培养体外培养35 基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用1 1、研究基因调控和基因功能；、研究基因调控和基因功能；2 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；提供材料；3 3、改造动物基因型，鉴定新基因和、改造动物基因型，鉴定新基因和/ /或其新功能，或其新功能，研究发育生物学；研究发育生物学；4 4、治疗遗传病，即基因治疗。、治疗遗传病，即基因治疗。5 5、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。366.3.1 酵母单杂交法酵

22、母单杂交法酵母单杂交酵母单杂交yeast onehybrid system)是一项是一项常用于研究常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。与蛋白之间的相互作用的方法。特点：通过该方法可以识别稳定结合于特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与与蛋白之间的相互作用，并通过筛选蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。6.3 蛋白质及其蛋白质及其RNA相互作用技术相互作用技术37转录激活结构域转录激活结构域activation doma

23、in，ADDNA结合结构域结合结构域DNA binding domain，BD基本原理：基本原理：顺式作用元件顺式作用元件报告基因得到表达报告基因得到表达激活激活Pmin启动子启动子真核生物转录因子基本构件真核生物转录因子基本构件38基本操作过程为基本操作过程为:cDNA与酵母转录激活结与酵母转录激活结构域构域AD融合融合导入酵母细胞导入酵母细胞基因产物基因产物蛋白质蛋白质顺式作用元件顺式作用元件激活激活Pmin启动子启动子报告基因得到表达报告基因得到表达筛选阳性克隆筛选阳性克隆测序分析测序分析cDNA替换了编码结合结构替换了编码结合结构域域(BD)蛋白基因蛋白基因39应用领域：应用领域：主要

24、用于确定某个主要用于确定某个DNADNA分子分子与某个与某个蛋白质蛋白质之间是否之间是否存在存在相互作用相互作用；用于用于分离分离编码结合于特定顺式调控元件或其他编码结合于特定顺式调控元件或其他DNADNA位点的位点的功能编码基因功能编码基因；验证验证反式转录调控因子的反式转录调控因子的DNADNA结合结构域结合结构域；准确准确定位定位参与特定蛋白质结合的参与特定蛋白质结合的核苷酸序列核苷酸序列。406.3.2 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast twohybrid system巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件

25、式结构modular特征，因为这些蛋白质往往由两个或两特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构结合结构域域DNA binding domain，BD和转录激活结构和转录激活结构域域activation domain，AD是转录激活因子发挥是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的子的BD和和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。的功能。41酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理蛋白编码基蛋白编码基因因X编码编码BD基因基因cDNA不不同片段同片段Y编码编码AD基因基因诱饵诱饵猎物猎物转化酵母细胞转化酵母细胞报告基因报告基因表达表达不表达不表达X与与Y编编码蛋白码蛋白有无相有无相互作用互作用有有无无4243Dicer酶酶双链双链RNAsiRNA